Las terapias para la RSCcPN hoy en día se enfocan principalmente en la inflamación tipo 2 y se lograron avances en la endotipificación y el tratamiento. De manera típica, los pacientes con RSCcPN sufren recurrencias de forma frecuente después de la cirugía o necesitan cursos repetidos de corticoesteroides orales con efectos adversos potenciales a largo plazo. La falta de respuesta a los corticoesteroides orales puede deberse en parte a una inflamación neutrofílica coexistente, que se describe tanto en el asma como en la RSCcPN.
En el asma, la presentación de una inflamación eosinofílica-neutrofílica mixta, asociada con una inflamación mixta tipo 2-tipo 17, se relaciona con un fenotipo más grave y difícil de controlar. Un análisis reciente del grupo de los autores demuestra que los grupos con el fenotipo clínico más grave se caracterizaban por una inflamación tipo 2 grave, así como por niveles elevados de marcadores de proteínas neutrofílicas. Por otro lado, el grupo de análisis mostró un grupo de pacientes con RSCcPN con sólo marcadores de neutrófilos elevados. Durante la muerte celular por trampas extracelulares de neutrófilos (NETosis) y la muerte celular por trampas extracelulares de eosinófilos (EETosis), el citosol y las proteínas de los gránulos se mezclan con el ADN condensado y se liberan en el espacio extracelular, donde pueden afectar la inflamación local. Estudios recientes describen la EETosis en el tejido en la RSCcPN, asociada con el depósito de cristales de Charcot-Leyden (CCL); se encontró que los CCL son responsables de la inducción y el mantenimiento de la inflamación neutrofílica en la RSCcPN. Por lo tanto, los autores buscaron caracterizar aún más las fuerzas impulsoras de la inflamación neutrofílica y su relación con la inflamación eosinofílica en las reacciones inmunes graves tipo 2.
MÉTODOS
Colección de muestra
Las muestras de tejidos y sangre se colectaron de pacientes del Departamento de Otorrinolaringología del Hospital Universitario Ghent (Bélgica) despues de recibir un consentimiento informado escrito para su inclusión. Se recolectaron muestras de pólipos nasales y/o tejido de la mucosa sinusal de pacientes sometidos a cirugía endoscópica sinusal por RSCcPN (n = 56) o RSCsPN (n = 35) y cornete inferior de pacientes sanos (sometidos a cirugía por obstrucción anatómica) (n = 27) en el Hospital Universitario de Ghent entre febrero 2012 y junio 2018. Las muestras de tejido se congelaron de forma rápida o se fijaron en paraformaldehído y se incluyeron en parafina. Para el aislamiento de neutrófilos de sangre periférica, se obtuvieron 100 ml de sangre de voluntarios sanos y se procesaron dentro de los 15 minutos posteriores a la recolección. Ninguno de los pacientes tomó glucocorticoides orales o intranasales, ni antibióticos 4 semanas previo a la cirugía. Los datos clínicos y las encuestas de síntomas se recolectaron en todos los pacientes que se incluyeron en el estudio. El estudio se aprobó por el Comité de Ética local del Hospital Universitario de Ghent.
Tinción
Inmunohistoquímica. Para preparar los portaobjetos de tejido para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, los tejidos de pólipos nasales y controles se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incrustaron en parafina. Estos portaobjetos de 4 μm de espesor se desparafinaron primero en xileno y se rehidrataron en concentraciones decrecientes de etanol. Las laminillas se bloquearon con BSA al 7.5% en PBS y se incubaron con anticuerpos primarios (proteína básica mayor antihumana monoclonal de ratón, BMK13 [MONOSAN, Sanbio, Uden, Países Bajos]; elastasa neutrofílica antihumana de ratón monoclonal, NP57 [Dako, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass]; histona antihumana policlonal H3 de conejo [Abcam, Cambridge, Reino Unido]) durante 16 horas a 4ºC. Los anticuerpos primarios se visualizaron mediante un kit de anticuerpos secundarios ligados a fosfatasa alcalina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dako). Por último, los portaobjetos se contrastaron con hematoxilina durante 1 minuto y se montaron con el medio de montaje Aquatex (Merck, Kenilworth, NJ). Se incluyeron controles de isotipo para todas las muestras. Se contó el número total de células positivas y se expresó como número de células/mm2 de tejido.
Inmunofluorescencia. Se prepararon portaobjetos con parafina y se desparafinaron como se mencionó antes. Después de la recuperación del antígeno (EET-, tinción de histona citrulinada 3 [CitH3] - y galectina-10 [Gal10]), los portaobjetos se bloquearon con BSA al 7.5% en PBS y se incubaron con anticuerpos primarios (proteína básica principal monoclonal antihumana de ratón, BMK13 [MONOSAN]; elastasa neutrofílica monoclonal antihumana de ratón, NP57 [Dako]; histona policlonal antihumana H3 de conejo [Abcam]; galectina-10 monoclonal antihumana de ratón, 561603 [R&D Systems, Minneapolis, Minnesota]) por 16 horas a 4ºC. Los anticuerpos primarios se visualizaron mediante anticuerpos IgG policlonales secundarios de cabra antirratón o anticonejo vía fluoresceína conjugada con isotiocianato (Thermo Fisher Scientific). Los portaobjetos se montaron con 4'-6-diamidino-2-fenilindol, medio de montaje que contenía dihidrocloro para contratinción nuclear. Los portaobjetos se analizaron con un microscopio confocal de barrido láser (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Para cada paciente, se contaron los NET, EET y CCL en 10 campos seleccionados al azar dentro del tejido. Se contó el número de células implicadas en la formación de NET o EET y se normalizó al número de neutrófilos o eosinófilos, de manera respectiva, y se expresó como porcentaje de neutrófilos o eosinófilos que generan NET o EET.
Mediciones de citocinas y proteínas
Los tejidos congelados de forma instantánea se pesaron, homogeneizaron y centrifugaron como se describió antes. Las muestras se analizaron para IL-5, IL-6, IL-8, IL-17, mieloperoxidasa y TNF-α con kits Luminex disponibles de manera comercial de R&D, e IFN-γ con un ELISA Quantikine disponible de manera comercial de R&D. Los niveles se midieron en un lector de matriz Bio-Plex 200 (Bio-Rad, Hercules, Calif). La proteína catiónica eosinofílica, IgE, e IgE específica para las enterotoxinas del Staphylococcus aureus (enterotoxina A estafilocócica, enterotoxina C estafilocócica y toxina 1 del síndrome de choque tóxico) se midieron mediante el método UniCAP (Thermo Fisher Scientific, Phadia AB, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones por debajo del límite de detección se consideraron negativas y se les dio un valor de la mitad del límite de detección.
PCR cuantitativa
El ARN se extrajo de muestras de tejido congeladas de forma instantánea como se describió antes. En resumen, el ARN se aisló con el Mini Kit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania) y, de manera posterior, se sintetizó el ADNc con el Kit iScript Advanced cDNA Synthesis (Bio-Rad). Se utilizó la PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar los niveles de ARNm de Gal10. Las cantidades calibradas normalizadas relativas se calcularon con el progama qBase+ (Biogazelle, Zwijnaarde, Bélgica). Los cebadores se adquirieron de manera comercial de Bio-Rad.
Análisis de citometría de flujo
La fracción de neutrófilos activados en tejido de pacientes con RSCsPN y aquellos con RSCcPN se analizó mediante citometría de flujo, de acuerdo con la expresión reducida de CD62L. La suspensión de una sola célula se preparó como se describió antes. Las células se marcaron con colorante vivo-muerto cercano al infrarrojo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), PE-Cy7 anti-CD45 (BioLegend, San Diego, California), PerCP-Cy5.5 anti-CD11b (BioLegend), azul del Pacífico anti-CD14 (BioLegend), PE anti-CD15 (BioLegend), isotiocianato de fluoresceína anti-CD16 (BD Pharmingen, BD, Franklin Lakes, NJ) y células presentadoras de antígeno anti-CD62L (BioLegend). Los neutrófilos se activaron mediante la activación posterior de células viables (tinción viva-muerta), células individuales (área de dispersión hacia adelante/altura de dispersión hacia adelante), leucocitos (CD45+), células mieloides (CD11b+), granulocitos (CD14-/dim) y neutrófilos (CD16+/CD15+), según los controles de fluorescencia menos uno, incluidos para cada marcador. Los neutrófilos activados se expresan como porcentaje de neutrófilos CD62L-.
Ensayos de actividad de proteasa de neutrófilos
La elastasa de neutrófilos y la actividad de catepsina G se analizaron en tejidos de controles y pacientes con RSCsPN y aquellos con RSCcPN. Se obtuvieron homogeneizados a partir de tejido congelado como se describió antes y se disolvieron en PBS+ Pen-Strep. El kit de ensayo de actividad de elastasa de neutrófilos fluorométrico (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) y el kit de ensayo de actividad de catepsina G colorimétrica (Abcam) se utilizaron según las instrucciones de los fabricantes. Se incluyeron duplicados y controles de fondo para todas las muestras en ambos ensayos.
Ensayo en cámara de Boyden
Se recolectaron neutrófilos de sangre periférica de sangre completa de voluntarios sanos como se describió antes. Se obtuvieron homogeneizados de controles y pacientes con RSCsPN y aquellos con RSCcPN como se describió arriba y se disolvieron en RPMI + Pen-Strep. Los compartimentos inferiores se llenaron con RPMI + 2% FCS + Pen-Strep (medio de cultivo de tejidos) como control negativo o 100 μg/ml de tejido homogeneizado de controles sanos o pacientes con RSCsPN o RSCcPN. De forma subsecuente, para cada condición, se cebaron 105 neutrófilos durante 20 minutos con 100 ng/mL de GM-CSF (PeproTech, Cranbury, NJ) y luego se dejaron migrar al compartimento inferior a través de filtros de 5μm de tamaño de poro (VWR International, Secaucus, NJ) durante 90 minutos a 37ºC. Los neutrófilos migrados se recolectaron, se tiñeron con una tinción de May Grunwald Giemsa y se cuantificaron para cada condición. Se realizaron dos experimentos independientes y los resultados se expresaron como índice de migración en comparación con el medio de cultivo de tejidos.
Ensayo de neutrófilos sobrevivientes
Se aislaron neutrófilos de sangre periférica y se prepararon homogeneizados de tejido como se describió antes. Se incubaron 106 neutrófilos en 100 μg/ml de tejido homogeneizado de controles sanos o pacientes con RSCsPN o RSCcPN durante 8 horas a 37ºC. Después de la incubación, los neutrófilos apoptóticos se tiñeron con un kit de detección de apoptosis de Anexina V (BD Pharmingen) y se analizaron con FACS Canto II con el programa FACS Diva (BD Bioscience, San José, Calif).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa de programa Prism GraphPad versión 8 (GraphPad Programa, San Diego, Calif). Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para evaluar las diferencias estadísticas entre 2 grupos. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparación múltiple para evaluar las diferencias estadísticas entre múltiples grupos. Las correlaciones se analizaron con una prueba de correlación no paramétrica de Spearman. Las significancias se expresaron con * P < .05, ** P < .01, *** P < .001 y **** P < .0001. Los valores de P < .05 se consideraron con significancia estadística.
RESULTADOS
Inflamación e infiltración neutrofílica grave en RSCcPN versus RSCsPN
De acuerdo con informes anteriores, los autores encontraron que la RSCcPN se asocia de forma clara con la inflamación tipo 2, mientras que la RSCsPN por lo general se relaciona más con la inflamación tipo 1. Los niveles tisulares de la IL-5 aumentaron de forma significativa en pacientes con RSCcPN en comparación con aquellos con RSCsPN (P < .0001) y en controles sanos (P < .001), y los niveles tisulares de IFN-γ aumentaron de forma significativa (P < .05) en pacientes con RSCsPN en comparación con aquellos con RSCcPN y en controles sanos. La caracterización de los pacientes estudiados se presenta en la Tabla I.
Sin embargo, la caracterización del tejido en términos de infiltración eosinofílica o neutrofílica mostró una imagen más versátil de lo que se anticipó de acuerdo con los perfiles de citocinas tanto en pacientes con RSCcPN como en aquellos con RSCsPN. Ambos grupos de pacientes contenían casos con infiltración baja de granulocitos, neutrofílica de forma predominante, eosinofílica de forma predominante e infiltración mixta neutrofílica-eosinofílica. De manera interesante, la mayoría de los pacientes con RSCcPN tipo 2 grave tenían una inflamación mixta neutrofílica-eosinofílica.
De acuerdo con estas observaciones en el tejido, se cuantificó el número de eosinófilos y neutrófilos en ambos grupos de pacientes. El número de eosinófilos se elevó de foma significativa en pacientes con RSCcPN en comparación con aquellos con RSCsPN (P < .0001) y en controles sanos (P < .001). De acuerdo con esto, se encontró que los niveles de proteína catiónica eosinofílica tisular aumentaron de manera significativa en pacientes con RSCcPN en comparación con aquellos con RSCsPN (P < .01) y en controles sanos (P < .0001). El número de neutrófilos se elevó de forma significativa en pacientes con RSCcPN en comparación con aquellos con RSCsPN (P < .05) y en controles sanos (P < .01). En consonancia con esto, los autores encontraron que los niveles tisulares de mieloperoxidasa se elevaron de forma significativa (P <0,01) en pacientes con RSCcPN en comparación con los controles, y la IL-8 y la IL-6 se elevaron de manera significativa en pacientes con RSCcPN en comparación con aquellos con RSCsPN (P < .05 y P < .01, de manera respectiva) y en controles sanos (P < .01 y P < .05). Estos hallazgos mostraron una profunda inflamación neutrofílica, que coexiste con inflamación eosinofílica en pacientes con RSCcPN grave tipo 2.
De forma interesante, no se observaron diferencias intergrupales en los niveles tisulares de IL-17, una fuerza impulsora importante para el reclutamiento, la supervivencia y la activación de los neutrófilos. Para investigar la posible participación de una inflamación tipo 17, los niveles de IL-17 se relacionaron con el número de neutrófilos en el tejido. De manera interesante, aunque el número de neutrófilos se elevó de forma significativa (P < .05) en los pacientes con RSCsPN con niveles altos de IL-17 en comparación con el grupo con IL-17 baja, no se encontró un aumento significativo en la relación de neutrófilos en pacientes con RSCcPN con IL-17 alta en comparación con los pacientes con RSCcPN con niveles bajos de IL-17.
Infiltración de neutrófilos asociada con inflamación tipo 2 en la RSCcPN
Como se informó de forma reciente, la presencia de CCL, la forma cristalizada de la proteína Gal10, resulta del proceso de EETosis y es un sello distintivo de la inflamación tipo 2 en la inmunidad de las vías respiratorias. Por lo tanto, se midieron los niveles de expresión de ARNm de Gal10 y se encontró que tenían un aumento significativo en pacientes con RSCcPN en comparación con controles sanos (P < .0001) y en pacientes con RSCsPN (P < .05). Además, la expresión de ARNm de Gal10 también se incrementó de forma significativa (P < .01) en pacientes con RSCsPN en comparación con los controles sanos. No se encontró una influencia significativa del asma o alergia concomitantes en los niveles de ARNm de Gal10 en los grupos de pacientes (datos no mostrados). Se cuantificó el número de CCL y se encontró aumento significativo (P < .01) en pacientes con RSCcPN en comparación con los controles sanos. De manera interesante, el número de neutrófilos se correlacionó de forma positiva con las fracciones relativas de EET (P < .001; r = 0.8047) y el número de CCL (P < .01; r = 0.6504) en pacientes con RSCcPN tipo 2, pero no en pacientes con RSCsPN y en controles.
Aumento de la activación de neutrófilos en la RSCcPN tipo 2
Debido a que tanto los neutrófilos como sus citocinas activadoras aumentan en la RSCcPN, se analizó y comparó la actividad de los neutrófilos tanto en el tejido de la RSCsPN como en el de la RSCcPN. Se sabe que los neutrófilos desprenden CD62L al activarse. Por lo tanto, se estudió la actividad de los neutrófilos de forma directa al analizar los neutrófilos derivados de tejidos en la expresión reducida de CD62L mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Los porcentajes de neutrófilos activados (CD62L-) aumentaron de forma significativa (P < .05) en el tejido de los pacientes con RSCcPN tipo 2 en comparación con aquellos con RSCsPN. Además, la actividad proteolítica de la catepsina G aumentó de forma significativa (P < .01) en el tejido de los pacientes con RSCcPN en comparación con los controles, y la actividad de la elastasa de neutrófilos aumentó de manera significativa (P < .05) en los pacientes con RSCcPN en comparación con controles y pacientes con RSCsPN.
Los neutrófilos son más propensos a entrar en NETosis en el tejido de la RSCsPN
Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos tienen la capacidad de generar trampas extracelulares en un proceso llamado NETosis. Se cuantificaron las NET en el tejido y se encontró que la NETosis estaba presente en 67% de todos los pacientes con RSCsPN y en 64% de los pacientes con RSCcPN. La tasa de NETosis aumentó de forma significativa (P < .05) en los pacientes con RSCsPN en comparación con los controles sanos. Los tejidos también se tiñeron para CitH3, un marcador temprano de NETosis, y se cuantificó la presencia de neutrófilos CitH3+ y se encontró un aumento significativo (P < .01) en los pacientes con RSCsPN en comparación con los controles. La elastasa se tiñó como positiva en los mismos puntos que CitH3, lo que confirmó la especificidad de la tinción CitH3 en los neutrófilos.
En el tejido de la RSCcPN, la NETosis se encontró principalmente en los bordes del epitelio (denudados) y se colocalizó con signos de colonización bacteriana. En el tejido de la RSCsPN, la NETosis se encontró de forma principal en el estroma y debajo de una membrana basal engrosada clara asociada con epitelio denudado.
Disminución de la supervivencia de los neutrófilos en el entorno de citocinas en RSCcPN
La migración diferencial de neutrófilos entre los diferentes entornos endotípicos se estudió mediante ensayos en cámara de Boyden, pero no reveló diferencias significativas en la migración de neutrófilos entre los diferentes grupos de pacientes. Para estudiar la influencia del entorno de las citocinas en la supervivencia de los neutrófilos, se cultivaron neutrófilos de sangre periférica en homogeneizados de tejido de los diferentes grupos de pacientes y se analizó la tasa de apoptosis después de 24 horas de incubación mediante un análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia. Los neutrófilos cultivados en homogeneizados de RSCsPN mostraron tasas de apoptosis más bajas de forma significativa (P < .05) en comparación con los neutrófilos cultivados en homogeneizados de controles sanos y pacientes con RSCcPN.
Para investigar la posible participación de la IL-17 en la supervivencia de los neutrófilos, los porcentajes de neutrófilos apoptóticos después de la incubación con homogeneizados se relacionaron con los niveles de IL-17 en estos homogeneizados. De manera interesante, no se encontró correlación en los homogeneizados de RSCcPN, mientras que la apoptosis de neutrófilos se correlacionó de forma inversa y significativa (P < .05; r = 0.5912) con los niveles de IL-17 en los homogeneizados RSCsPN.
Discusión
Si bien se confirmó la consideración general de que la RSCsPN está mediada de forma principal por un patrón de inflamación no tipo 2 y la RSCcPN por un patrón inflamatorio tipo 2, se demuestra una imagen muy heterogénea de inflamación neutrofílica y eosinofílica entre todo los pacientes con RSC. Tanto el conteo de neutrófilos tisulares y los niveles de proteínas relacionadas con los neutrófilos demostraron un aumento de la inflamación neutrofílica en el grupo de pacientes con RSCcPN. Esto concuerda con un grupo de análisis previo que muestra una presencia aumentada de forma intensa de marcadores de proteínas neutrofílicas en los grupos tipo 2 alto que contienen los pacientes con RSCcPN más graves y difíciles de tratar. Algunos reportes afirman que el número de neutrófilos se eleva en la RSCsPN en comparación con la RSCcPN, mientras que otros estudios encuentran que los números son comparables o más elevados en la RSCcPN. Estos resultados contradictorios se atribuyen probablemente a la existencia de diferentes endotipos de RSC, algunos de los cuales tienen una clara inflamación neutrofílica coexistente con eosinofilia.
De manera interesante, los neutrófilos también se activan más, y las proteasas neutrofílicas elastasa y catepsina G tienen mayor actividad en la RSCcPN tipo 2. Esto indica que los neutrófilos no sólo son más frecuentes en un entorno tipo 2, sino que también tienen un potencial mayor para afectar la inflamación local por medio del aumento de la actividad proteolítica. Se sabe que la elastasa y la catepsina G acentúan la secreción y la activación de las citocinas de la familia de la IL-1 como la IL-1β y la IL-33. Estas citocinas son jugadores clave en la inducción de respuestas tipo 2, ya que funcionan como quimioatrayentes para las células TH2 y estimulan la producción de citocinas tipo 2 en los pólipos nasales eosinofílicos. Además, la elastasa de los neutrófilos en sí tiene un impacto importante en la inflamación de las vías respiratorias ya que mejora la hiperplasia de células caliciformes y la producción de moco.
A pesar del número elevado de neutrófilos y el aumento de la actividad neutrofílica en pacientes con RSCcPN, no se pudo encontrar in vitro migración elevada de neutrófilos ni supervivencia en homogeneizados de tejido de RSCcPN. Se especula que el aclaramiento de neutrófilos se afecta en el tejido de la RSCcPN o que el reclutamiento activo de neutrófilos dentro del tejido de la RSCcPN requiere tejido intacto. En el asma grave, una inflamación neutrofílica-eosinofílica mixta se asocia con una inflamación mixta tipo 2/17. A pesar de las similitudes observadas en la inflamación mixta de las vías respiratorias, no se observó una elevación notable de la IL-17 en los pacientes con RSCcPN, ni hubo correlación entre los niveles de la IL-17 y el número de neutrófilos en estos pacientes. Esto se asemeja con un grupo de análisis reciente de Tomassen et al que muestra niveles aumentados de proteínas relacionadas con los neutrófilos, pero no niveles elevados de la IL-17 en pacientes con RSCcPN tipo 2 alto. De forma reciente, los autores demostraron que los CCL, se presentan de manera prominente en pacientes con RSCcPN grave, y pueden evocar una inflamación neutrofílica. Además, se observó un aumento de la afluencia de neutrófilos en pulmones múridos con la inyección de CCL. De acuerdo con estos hallazgos, se muestra aquí que el número de neutrófilos en el tejido se correlacionó con la extensión de la EETosis y el depósito de CCL en la RSCcPN. A pesar de la presencia de CCL en pacientes con RSCsPN, no obstante, no se encontró correlación con la infiltración de neutrófilos. Esto podría atribuirse posiblemente a las diferencias en el tamaño de los CCL que se observaron en ambos grupos, ya que también se sabe que el tamaño de los patógenos extracelulares es el que afecta el mecanismo de aclaramiento de los neutrófilos. La colonización por Staphylococcus aureus−otro sello distintivo de la RSCcPN−también se relaciona con el aumento en la migración de los neutrófilos en la RSCcPN y podría tener un papel destacado in vivo que desencadena la neutrofilia en la RSCcPN. Debido a que la carga bacteriana general no difiere entre la RSCsPN y la RSCcPN, se cree que la inflamación neutrofílica incrementada observada en la RSCcPN no sólo se debe a la colonización bacteriana. Sin embargo, de forma previa se demostraron variaciones en la composición de la microbiota bacteriana sinusal que se relacionan con la heterogeneidad de la RSC y por lo tanto también pueden contribuir a las diferencias en la activación neutrofílica y la NETosis. En este estudio, no se analizaron las diferencias entre la composición local bacteriana en relación con la inflamación neutrofílica, pero sería interesante hacerlo para estudios futuros.
Se encontró que una fracción considerable de neutrófilos sufre NETosis en los grupos de pacientes RSCsPN y RSCcPN. Tanto el número relativo como el absoluto de neutrófilos que experimentan NETosis aumentaron en RSCsPN. Esto está en sintonía con el hallazgo de los autores de aumento de la supervivencia de los neutrófilos en la RSCsPN. La NETosis se propuso como un tipo de muerte celular programada lenta que es propensa a ocurrir en los neutrófilos con una mayor supervivencia. Si bien CitH3 es un marcador temprano y consistente de NETosis, las NET por sí mismas pueden ser bastante frágiles. Las trampas extracelulares se pueden desintegrar de una manera relativamente rápida, en especial en un ambiente tipo 2 grave con un número mayor de macrófagos y DNasas bacterianas. Múltiples estimulantes pueden inducir la formación de NET e incluso el tipo de NETosis−vital o suicida−es dependiente de los incentivos ambientales. De forma reciente, se reportó que los CCL podrían inducir NETosis e inflamación neutrofílica en la RSCcPN, y que la NETosis podría inducir una respuesta tipo 2 mediante la liberación de ADN bicatenario extracelular. En la RSCcPN, la NETosis se ubicó de manera principal en sitios de epitelio a veces denudado. De manera interesante, los mediadores neutrofílicos como la catepsina G y la elastasa se liberan de forma amplia durante la NETosis y estimulan las respuestas inmunes de tipo 2 como se describió antes.
La NETosis en RSCcPN se encontró de manera principal de forma subepitelial y en estrecha ubicación con signos de infección bacteriana, mientras que la NETosis en la RSCsPN se encontró de manera principal de forma más profunda en el tejido. Queda por aclarar si la NETosis se activa por medio de vías similares en los diferentes endotipos. La NETosis en la RSCcPN puede impulsarse por mediadores relacionados con el tipo 2 o puede relacionarse con el aumento de la colonización bacteriana y la formación de biopelículas en sitios de epitelio denudado. En la RSCsPN, la NETosis se encuentra de manera principal en el estroma y debajo de una membrana engrosada de forma clara, sin una asociación evidente con la colonización bacteriana. Esto podría indicar que otros mediadores como el IFN-γ o la IL-12, ambos inductores conocidos de NETosis y elevados de manera específica en esos pacientes, podrían iniciar la NETosis en el tejido de la RSCsPN.
Debido al patrón inflamatorio predominante TH2, las terapias que tratan las enfermedades crónicas de las vías respiratorias en la actualidad−como anti-IL5 (Ra), anti-IL4R/IL13R o glucocorticoides−se enfocan principalmente en atacar la inflamación eosinofílica TH2. Con el establecimiento de estas terapias, se lograron avances considerables, pero aún algunos pacientes no responden al tratamiento. Aquí se muestra que la contribución de los neutrófilos−por sí mismos por medio de una mayor actividad, y mediante una mayor afluencia y NETosis o en combinación con inflamación eosinofílica−podría ser mucho más importante de lo que se pensaba de forma inicial, en especial en un contexto TH2. De manera interesante, dado que los CCL son muy estables y permanecen presentes en los sitios de inflamación durante meses, aún podrían afectar la inflamación neutrofílica mucho después del inicio del tratamiento. Además, estudios recientes mostraron una capacidad reducida de respuesta a los corticoesteroides en el asma neutrofílica y la RSCcPN. Todo esto indica que la inflamación neutrofílica se pasa por alto en la actualidad en las asignaciones de terapias dirigidas a la inflamación eosinofílica TH2 y puede necesitar más atención para permitir una mayor mejoría en los tratamientos de los pacientes. Por lo tanto, se especula que la identificación de un aumento de los marcadores de activación de los neutrófilos en pacientes con RSC puede evolucionar como uno de los parámetros críticos para determinar la respuesta al tratamiento en pacientes con RSC. El desarrollo y la coadministración de nuevos fármacos dirigidos a los neutrófilos activados por los CCL pueden completar la respuesta a los antagonistas de las citocinas tipo 2 en pacientes con una inflamación mixta eosinofílica-neutrofílica.
En general, el comportamiento de los neutrófilos observado en la RSCcPN es comparable al comportamiento de los neutrófilos en las infecciones u otras enfermedades crónicas de las vías respiratorias mediadas por el tipo 2. En los sitios de infección, los neutrófilos también inducen la formación de NET y secretan proteasas para promover el aclaramiento bacteriano. En el asma, los neutrófilos muestran una esperanza de vida de 5 días más debido a la disminución de la apoptosis. Este aumento de la vida útil puede sentar las bases para una mayor activación y desarrollo de NETosis, que podría contribuir a la gravedad de la enfermedad. También en muestras de cornetes nasales de pacientes con rinitis alérgica, el porcentaje de neutrófilos activados fue mayor de forma significativa que el porcentaje de neutrófilos no activados, mientras que este no fue el caso en el tejido de pacientes que no eran alérgicos. La diferencia entre las infecciones habituales y las infecciones en enfermedades crónicas tipo 2 parece ser el desencadenante de la inflamación neutrofílica local. La migración de neutrófilos a los sitios de infección está mediada principalmente por el patrón molecular asociado al daño, IL-8 y leucotrienos, mientras que en las inflamaciones tipo 2, esta forma tradicional de migración de neutrófilos parece anularse por mediadores de la inflamación eosinofílica tipo 2, como como los CCL. También en los sitios de infección, los neutrófilos liberan proteínas y forman NET en respuesta directa a la invasión bacteriana, mientras que en la RSCcPN, estas funciones no son desencadenadas de forma exclusiva por la infección bacteriana, sino también por mediadores tipo 2 como los eosinófilos y los CCL.
En conclusión, aquí se demostró una profunda participación de los neutrófilos en la RSCcPN tipo 2 grave, inducida por productos de inflamación eosinofílica e independiente de la IL-17. Los neutrófilos tienen un potencial alto para afectar la inflamación local en la RSCcPN mediante un estado mayor de activación, aumento en la actividad proteolítica de la elastasa y la catepsina G, la formación de NET y, por último, el empeoramiento de la inflamación tipo 2. Estos mecanismos podrían resultar en un círculo de agravamiento en la inflamación en pacientes con RSCcPN más grave con inflamación mixta eosinófila-neutrofílica, y llevar a la insensibilidad a los glucocorticoesteroides y los biológicos tipo 2; esta hipótesis necesita apoyo adicional.
A substantial neutrophilic inflammation as regular part of severe type 2 chronic rhinosinusitis with nasal polyps
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC
Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL
Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Rosa Ivett Guzmán Avilán Profesor
Dra. Daniela Robles Rodríguez Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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