Los cambios en la bioquímica de la superficie ocular resultantes del picor, la inflamación y el frotamiento de los ojos asociados a la AO aún no se investigaron en una población australiana. Los primeros hallazgos de Weed et al identificaron un vínculo fisiológico entre una condición de ectasia corneal degenerativa irreversible llamada queratocono y la AO. En el queratocono, la córnea comienza a adelgazarse y a caerse con el tiempo, lo que causa una pérdida progresiva de la visión que puede exacerbarse por el frotamiento de los ojos. Se cree que el frotamiento excesivo de los ojos debido a la AO es un desencadenante de esta afección debido al aumento del estrés y la presión mecánicos, lo que causa de forma potencial cambios en la forma de la córnea y la bioquímica de la superficie ocular. Un estudio de 2008 que analizó las comorbilidades del queratocono encontró una correlación fuerte entre los pacientes con fiebre del heno que experimentaban síntomas de AO y queratocono al mismo tiempo (p = 0.007). Esto indica que el picor asociado a la alergia, y por lo tanto el frotamiento de los ojos, puede tener un efecto directo en la superficie ocular a nivel tisular y celular. La investigación adicional sobre los cambios bioquímicos que ocurren en la superficie ocular debido a la alergia, y el potencial para la identificación de biomarcadores, fueron el punto focal de la investigación emergente de la ectasia corneal para comprender mejor las condiciones como el queratocono. Los estudios encontraron expresión diferencial de proteínas como queratinas, inmunoglobulinas y otras proteínas típicas de la superficie ocular relacionadas con la composición estructural, la inflamación y la homeostasis que ocurren en individuos con queratocono en comparación con los controles sanos (CS) que pueden utilizarse en futuras investigaciones como biomarcadores del queratocono.
El descubrimiento de biomarcadores desempeñó un papel crucial en la investigación emergente en una amplia variedad de enfermedades oculares y no oculares. En los últimos años, los marcadores bioquímicos de la enfermedad utilizados para identificar con precisión el estado de la enfermedad o el nivel de progresión de la enfermedad adquirieron cada vez mayor importancia en la investigación médica. Estos marcadores bioquímicos o biomarcadores pueden incluir proteínas, lípidos, metabolitos, genes o cualquier otro cambio bioquímico que pueda utilizarse para distinguir los estados de enfermedad de los CS. La investigación de biomarcadores de AO aún no se estudió con suficiente detalle, pero ayudaría en gran medida a establecer un fuerte vínculo bioquímico entre la AO y la ectasia corneal por primera vez, al tiempo que se identifican una gran cantidad de nuevos objetivos para estudios in vitro e in vivo de biovías y tratamientos de AO. Comenzar con estudios proteómicos sería ventajoso, ya que permite una visión general amplia de los cambios a nivel de tejido que ocurren dentro de muestras biológicas como las lágrimas humanas y se pueden desarrollar para obtener una visión general completa de los cambios de la superficie ocular que ocurren en la AO.
Li et al. y Tomazic et al., ambos utilizaron de forma previa técnicas de espectrometría de masas (MS) de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) y espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF/TOF) para evaluar los cambios proteómicos en la superficie ocular en lágrimas humanas de pacientes con AO en comparación con los CS. A pesar de las similitudes en las técnicas analíticas, sus técnicas de recolección y preparación de muestras no fueron las mismas. Como tal, sus hallazgos no mostraron ninguna superposición de proteínas expresadas de manera diferencial a pesar de que ambas eran técnicas de escopeta, lo que indica que quizás la combinación de métodos de recolección, preparación y análisis de muestras utilizados fueron demasiado diferentes para la comparación. El estudio más reciente de Neil et al. en 2020 utilizó tecnología electroforética automatizada (AET) para caracterizar el proteoma de las lágrimas de pacientes con AO. La AET se volvió más popular en los últimos años debido a su costo financiero y tiempo de ejecución menores, pero carece de la sensibilidad de las técnicas MS como LC-MS/MS.
Tomazic et al. también investigaron el efecto longitudinal de la temporada alta de alergias frente a la temporada baja en las lágrimas en una carta al editor publicada en 2018. Este artículo mostró que sólo la microglobulina beta-2, la lactotransferrina (LTF) y la lipocalina-1 (LCN1) se expresaron de manera diferencial entre la AO y los CS en la temporada alta de alergias; y la cistatina-S, la lactoperoxidasa y el homólogo B de la proteína 16 del gránulo de zimógeno se expresaron de manera diferencial en la temporada baja. Esto demostró en última instancia que se producían diferencias en el proteoma de la superficie ocular entre los pacientes con AO y los CS incluso durante las temporadas bajas, pero carecían de sensibilidad suficiente, como lo demuestra la detección de sólo 90 proteínas totales, de las cuales sólo 22 se evaluaron para una expresión diferencial significativa después del filtrado de datos. Además, el estudio de Tomazic se llevó a cabo en Austria, donde el clima durante la temporada baja es muy diferente al de Australia. En Australia, durante la temporada baja, los alérgenos como el polen de las gramíneas siguen estando en el aire y, por lo tanto, pueden iniciar respuestas alérgicas, aunque en menor medida. Esto puede tener un gran impacto en la expresión de proteínas homeostáticas y protectoras en la superficie ocular en pacientes australianos con AO en comparación con los pacientes europeos con AO que experimentan climas más fríos en temporada baja.
Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo evaluar la expresión diferencial de proteínas en lágrimas humanas de pacientes con AO en comparación con los pacientes con antecedentes familiares tanto en la temporada alta de alergia como en la temporada baja, con un nivel de sensibilidad no alcanzado de forma previa en estudios de AO. La adición de un componente transestacional a este estudio piloto exploratorio es muy beneficiosa para estudiar los posibles biomarcadores proteicos de la AO en varias estaciones y es un primer paso para validar las asociaciones encontradas entre los biomarcadores y la expresión de los síntomas. Esta investigación será fundamental para futuras aplicaciones en el diagnóstico y la terapia de la AO para reducir e investigar los efectos nocivos de la inflamación, la irritación y el frotamiento de los ojos en la superficie ocular de los pacientes con AO.
2 Métodos
2.1 Población de estudio
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las pautas de ética de investigación recomendadas por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad de Deakin (estudio DUHREC n.º 2021-189). La población del estudio consistió en 19 adultos de entre 18 y 45 años de Victoria, Australia. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes del inicio del estudio. Se incluyeron en el estudio 14 pacientes con AO y 5 controles sanos. Los participantes asistieron a dos sesiones cada uno, una durante la temporada alta de alergia (noviembre de 2021, primavera) y otra durante la temporada baja (junio de 2022, invierno).
2.2 Secuencia del examen clínico
Ambas sesiones comenzaron con cuestionarios que evaluaban los datos demográficos de los participantes, su historial de salud ocular y los síntomas y la calidad de vida. La visión mejor corregida se evaluó mediante una tabla electrónica LogMAR, seguida de una evaluación de la superficie ocular con lámpara de hendidura.
La evaluación de la superficie ocular con lámpara de hendidura se realizó antes y después de la recolección de la muestra de lágrimas. Antes de la recolección de lágrimas, se inspeccionó la superficie ocular para detectar enrojecimiento con luz blanca y se calificó con la escala de calificación de Efron. Después de la recolección de la muestra de lágrimas, se volvió a evaluar la superficie ocular de los participantes con un tinte de fluoresceína para verificar que no hubiera daño en la superficie ocular debido a las pruebas realizadas.
2.3 Cuestionarios
Los participantes completaron el cuestionario de Calidad de vida en niños con queratoconjuntivitis primaveral (QUICK), que consta de dos secciones, una para la puntuación de los síntomas y otra para la calidad de vida. Ambas secciones se evalúan en una escala de 0 a 6. La puntuación de los síntomas de este cuestionario se utilizó para clasificar a los participantes como AO o CS después de la conversión a una escala de 0 a 100 con la siguiente fórmula: Puntaje convertido de síntomas = (Puntaje total QUICK/ Puntaje más alto posible − puntaje más bajo posible)*100.
Se determinó que una puntuación de síntomas mayor que 1 era indicativa de AO, ya que indicaba la presencia de síntomas de AO.
También se administró el minicuestionario de calidad de vida de rinoconjuntivitis (miniRQLQ) para evaluar los cambios en la calidad de vida debido a la AO a lo largo de las estaciones. Se utilizó un cuestionario demográfico adicional para evaluar la elegibilidad de los participantes. Los participantes menores de 18 años o mayores de 45 se excluyeron del estudio debido a un posible sesgo relacionado con la edad. Se examinó a los participantes para conocer su historial de salud ocular y general, y cualquier informe reciente de infección, cirugía o lesión ocular fue motivo de omisión del estudio, así como el embarazo y la lactancia.
2.4 Toma de muestra de lágrimas
Se recogieron muestras de lágrimas de todos los participantes mediante el método de flujo microcapilar de vidrio (GMF). Se recogieron entre 5 y 45 μL de lágrimas del canto lateral de cada ojo y se almacenaron en hielo seco hasta su transferencia a un congelador a -80 °C. Se agruparon muestras de ambos ojos para garantizar un volumen adecuado para el análisis.
2.5 Ensayo de ácido bicinconínico
Se utilizó el kit Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para determinar la concentración de proteínas de cada muestra de lágrima con el protocolo de microplaca descrito en el manual del kit de análisis de proteínas Pierce BCA. El diluyente utilizado para la preparación del estándar y de la muestra fue agua MilliQ. El análisis tuvo un rango de detección de 125–2000 μg/mL.
Las muestras de lágrimas congeladas se descongelaron en hielo. Se transfirió una alícuota de 5 μL de cada muestra a tubos Eppendorf estériles etiquetados. Cada alícuota se diluyó hasta 25 μL con agua milliQ para prepararla para el ensayo. Se pipetearon 10 μL de cada muestra diluida y estándar en los pocillos de una placa de 96 pocillos por duplicado. Se añadieron 200 μL de reactivo de trabajo (preparado de acuerdo con el manual del kit de ensayo de proteínas Pierce BCA) a cada pocillo. La placa se selló con una cubierta de placa, se agitó durante 30 segundos a una velocidad moderada y luego se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Una vez incubada, se retiró la cubierta de la placa y se procesó en un lector de microplacas multimodo Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) a 562 nm. Se generó una curva estándar con el software SkanIt™ (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para determinar la concentración de cada muestra desconocida en μg/mL.
2.6 Extracción de proteínas
Las muestras de lágrimas se diluyeron a una concentración de 1 μg/μL con datos de BCA y agua milliQ. Se utilizaron 11.5 μg de proteína en 11.5 μL de milliQ por digestión con tripsina y purificación en columna S-trap™ (ProtiFi, EE. UU.). Se redujeron 11.5 μL de proteína con 0.5 μL de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 10 mM a 55 °C durante 15 minutos. Luego, la muestra se alquiló con 2.5 μL de yodoacetamida 50 mM y se incubó en la oscuridad durante 45 minutos a temperatura ambiente. Luego, se agregaron 2.5 μL de acidulante de ácido fosfórico hasta un [v/v] final de 2.5 %. La muestra se diluyó 1:6 con un tampón de unión y lavado compuesto por 100 mM de TEAB en metanol a 90 % para transferir a la columna de centrifugación S-trap.
La muestra se centrifugó a 4000 x g durante 30 segundos entre cada uno de los cuatro pasos de lavado totales con 150 μL de tampón de lavado cada vez. Luego, la trampa S se centrifugó una última vez a 4000 x g durante 1 minuto para garantizar que todo el tampón se eliminara por completo de la columna.
Las proteínas atrapadas en la columna se digirieron con 1 μg de tripsina en 50 mM de TEAB. Esta solución se aplicó a la parte superior de la columna y se dejó incubar durante la noche en un baño de agua a 37 °C. Al día siguiente, los péptidos se eluyeron primero con 40 μL de 50 mM de TEAB que se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego 40 μL de ácido fórmico a 0.2 % y, por último, 40 μL de acetonitrilo a 50 % [v/v] en agua destilada. Posterior a casa paso se centrifugó a 4000 x g durante 1 minuto. El eluyente se colocó en un concentrador de vacío Savant SpeedVac™ (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar el acetonitrilo de la muestra. Luego, los péptidos eluidos se liofilizaron durante la noche y se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron para el análisis.
2.7 Preparación de la biblioteca
Los péptidos secos se resuspendieron en acetonitrilo a 2 %/ácido trifluorAOcético a 0.05 % [v/v] en agua destilada hasta una concentración final de péptidos de ~0.5 μg/μL. Se tomaron alícuotas de 2 μL de cada muestra en una columna LC de plástico limpia y etiquetada y se usaron para la preparación de la biblioteca.
2.8 Cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas, etiquetado y cuantificación de proteínas
La adquisición independiente de datos (DIA) se llevó a cabo en el espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los ajustes de voltajes de nanoelectrospray, RF del embudo de iones y temperatura capilar fueron 1,9 kV, 50 %, 275 °C, de forma respectiva. Se realizó un escaneo de reconocimiento con un rango am/z de 350 a 1400, una resolución de 120 000, un objetivo de control automático de ganancia (AGC) normalizado de 250 %, un tiempo máximo de captura de iones de 50 ms antes de 49 ventanas DIA con una ventana de aislamiento m/z de 13.7, un rango m/z de iones precursores de 361-1033, un rango de escaneo MS/MS de m/z 200-2000, una resolución de 30 000, un AGC de 1e6, un tiempo máximo de captura de iones de 55 ms y una energía de colisión normalizada (NCE) de 30 %.
Los datos de DIA LC-MS se analizaron con Spectronaut 16 con la configuración predeterminada de DIA directa. En resumen, la especificidad de la enzima de digestión se estableció en tripsina y se permitieron hasta 2 escisiones fallidas. La tolerancia de masa para escaneos MS y MS/MS de escaneo completo se estableció en modo dinámico, lo que optimiza la tolerancia de masa en función de la calibración de masa interna previa a la búsqueda. Los criterios de búsqueda incluyeron la carbamidometilación de cisteína como modificación fija, así como la oxidación de metionina y la acetilación (proteína N-terminal) como modificaciones variables. Los datos se buscaron en la base de datos de secuencias humanas UniProt. La tasa de falsos descubrimientos (FDR) se estableció en 1 % en la coincidencia del espectro de péptidos (PSM), el nivel de péptidos y proteínas. Se habilitó MaxLFQ de la intensidad a nivel de MS/MS para la cuantificación sin etiqueta y no se habilitó la imputación. Los conjuntos de datos generados para este estudio se pueden encontrar en el Consorcio ProteomeXchange por medio del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD051204.
2.9 Análisis estadístico
La identificación de la abundancia global de proteínas se realizó con el programa MaxQuant Perseus (v 2.0.9.0). Los datos se transformaron en Log 2. Se utilizaron dos pruebas t de muestra para identificar proteínas expresadas de forma diferencial con valores de umbral S0 de 0,1 y se filtró por cambio de pliegue Log2 (Log2 FC) de x>1; x<-1 y significancia (p < 0.05). La visualización de datos se complementó con IBM ® SPSS ® Statistics.
3 Resultados
3.1 Datos demográficos de los participantes
La tabla 1 muestra el número de participantes, la distribución por género, la edad media, la puntuación media de los síntomas del cuestionario QUICK y la concentración media de proteínas en cada uno de los cuatro grupos. No se encontraron diferencias significativas en las proporciones de género o edad entre los grupos (p > 0.05).
Los participantes del grupo AO obtuvieron una media ± desviación estándar de 27.63 ± 17.31 durante la temporada alta de alergia y 21.61 ± 16.41 durante la temporada baja de alergia en el cuestionario QUICK, lo que muestra una tendencia descendente en la gravedad de los síntomas desde la temporada alta de alergia hasta la temporada baja.
La concentración media de proteínas de las lágrimas fue de 7.6 ± 2.05 μg/μL, medida mediante BCA. No se encontraron diferencias significativas entre grupos o estaciones (p > 0.05) en cuanto a la concentración de proteínas.
3.2 Proteínas más abundantes
Se identificaron un total de 1267 proteínas en las muestras de lágrimas de pacientes con AO y CS en ambas estaciones mediante LC-MS/MS. Las 10 proteínas más abundantes entre los CS de ambas estaciones se muestran en la tabla 2, incluidas la lisozima C (LYZ), LTF, proteína rica en prolina 1 (OPRPN), fragmentos de inmunoglobulina, queratinas, fosfolipasa A2 (PLA2G2A), proteína rica en prolina 4 (PRR4) y LCN1. Ninguna de estas proteínas mostró cambios significativos en la expresión entre los grupos durante las comparaciones grupales.
3.3 Comparación del proteoma lagrimal humano de pacientes con AO frente a los de los CS con respecto a la estación
3.3.1 Temporada alta: AO vs CS
Veintitrés proteínas mostraron una diferencia significativa en la expresión entre los grupos (p < 0.05), como se muestra en la Figura 1A y en la Tabla complementaria S1. De éstas, nueve proteínas mostraron una expresión mayor, mientras que catorce mostraron una expresión menor en pacientes con AO frente a los CS durante la temporada pico de alergia.
La Figura 1A y la Figura Suplementaria S1 muestran todas las proteínas expresadas de manera diferente en pacientes con AO en comparación con los CS durante la temporada pico de alergia. Las tres proteínas principales que mostraron la mayor disminución en la expresión, como lo demuestra el Log2 FC negativo en AO en comparación con los CS durante la temporada pico de alergia, fueron la catepsina G (CTSG) (p = 0.042), la elastasa de neutrófilos (ELANE) (p = 0.022) y la endonucleasa del colgajo 1 (FEN1) (p = 0.003). FEN1 también tuvo el cambio más diferente de forma significativa en la expresión entre AO y CS durante la temporada pico de alergias (p = 0.003). Las tres proteínas principales con el mayor aumento en la expresión según lo determinado por Log 2 FC fueron la probable helicasa de ARN dependiente de ATP (DHX35) (p = 0.012), la alfa-amilasa (AMY1A/B/C) (p = 0.019) y la queratina tipo II citoesquelética 2 oral (KRT76) (p = 0.049).
3.3.2 Temporada baja: AO vs CS
Veintiún proteínas mostraron una diferencia significativa en la expresión entre los grupos (p < 0.05). Ocho proteínas mostraron una expresión mayor entre los grupos AO y CS, y trece disminuyeron durante la temporada baja. Se puede ver una descripción general de estas proteínas en el gráfico de volcanes en la Figura 1B y la Figura suplementaria S1 .
Como se muestra en la Figura 1B y la Figura Suplementaria S1 , las tres proteínas con la mayor disminución en la expresión entre los pacientes con AO y los CS en temporada baja según lo determinado por Log2 FC son el factor de crecimiento derivado de mieloides (MYDGF) (p = 0.031), la subunidad alfa de la proteína de protección f-actina (CAPZA1/2) (p = 0.046) y la proteína de unión a la proteína activadora de GTPasa Ras (G3BP1) (p = 0.013). G3BP1 tuvo la mayor significación general en la expresión diferencial entre los pacientes con AO y los CS durante la temporada baja (p = 0.013). Las tres proteínas principales con el mayor aumento en la expresión, como lo muestra Log2 FC, incluyen la inmunoglobulina pesada constante gamma 2 (IGHG2) (p = 0.034), la inmunoglobulina pesada variable 1-69 (IGHV1-69) (p = 0.026) y la inmunoglobulina lambda constante 7 (IGLC7) (p = 0.045).
3.4 Comparación de los cambios longitudinales/estacionales en el proteoma lagrimal humano con respecto al estado de alergia
3.4.1 Diferencias estacionales entre los CS
S1 muestra todas las proteínas expresadas de manera diferente entre los CS, lo que indica diferencias en el proteoma de los grupos de control durante las temporadas pico y de alergia baja. Trece proteínas en total se expresaron de manera diferencial (p < 0.05). De estas, tres proteínas mostraron una mayor expresión y nueve mostraron una menor expresión en los CS entre la temporada pico y la temporada de alergia baja. De todas las proteínas expresadas de manera diferencial, las tres con el mayor grado de Log2 FC negativo son la beta-1,3-galactosil-O-glicosil-glicoproteína beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa 3 (GCNT3) (p = 0.031), la proteína 1 que contiene el dominio CUB y sushi (CSMD1) (p = 0.049) y la queratina tipo II (KRT6B) (p = 0.001). KRT6B también fue la proteína que cambió de manera más significativa entre las estaciones (p = 0.001). Los CS entre la temporada alta y la temporada baja de alergias (p = 0.001). Las 3 proteínas con mayor aumento, como se muestra en el Log 2 FC, son ELANE (p = 0.029), IGLC7 (p = 0.035) y proteína 1 que interactúa con el receptor de glutamato (GRIP1) (p = 0.039).
3.4.2 Diferencias estacionales entre pacientes con AO
Once proteínas mostraron diferencias significativas en la expresión entre los pacientes con AO entre la temporada alta y la temporada baja de alergia (p < 0.05). Tres aumentaron en los pacientes con AO de la temporada alta de alergia frente a la temporada baja, mientras que ocho disminuyeron. Estos cambios se muestran en S1. Las tres proteínas con la mayor magnitud de expresión disminuida evidenciada por el grado de FC Log 2 incluyen keratocan (KERA) (p = 0.007), proteína 1 que contiene el dominio SCAN (SCAND1) (p = 0.039) y miembro 3 de la subfamilia M del canal de cationes de potencial transitorio del receptor (TRPM3) (p = 0.040). De manera controvertida, las tres proteínas que aumentaron más entre los pacientes con AO entre las temporadas de actividad pico y baja fueron la probable inmunoglobulina kappa variable 3-7 no funcional (IGKV3-7) (p = 0.047), la proteína que interactúa con la proteína cinasa 11 de serina/treonina (STK11IP) (p = 0.033) y la proteína similar al factor de elongación 1-delta (EEF1DP3) (p = 0.028). La proteína expresada de manera diferencial fue la queratina tipo II (p = 0.005).
4 Discusión
El objetivo central de este estudio fue evaluar los biomarcadores proteómicos de AO en muestras de lágrimas humanas durante la temporada alta (primavera-verano) y la temporada baja (invierno) de alergias en Victoria, Australia. Se detectó la expresión aberrante de 23 proteínas entre pacientes con AO y CS durante la temporada alta ( Figura 1A ), y 21 se expresaron de manera diferencial entre pacientes con AO y CS durante la temporada baja de alergias (Figura 1B ). Cuando se compararon entre sí, sólo una proteína de estructura celular clave (es decir, CAPZA1/2) disminuyó su expresión de manera constante entre pacientes con AO y CS en ambas estaciones. Las proteínas desreguladas se relacionaron en gran medida con las respuestas inmunitarias, la inflamación, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la homeostasis en ambas estaciones, lo que indica cambios dañinos en la superficie ocular de los pacientes con AO frente a los CS, de forma independiente de la estación ( Figura 2 ).
El proteoma lagrimal sano se investigó de forma exhaustiva en un estudio realizado por Dor et al. en 2019. Este estudio utilizó muestras de lágrimas agrupadas recolectadas con tiras de Schirmer y MS para el análisis. Dor et al. demostraron que en las lágrimas de los CS, se expresaban proteínas como la inmunoglobulina pesada constante alfa 1 (IGHA1), la inmunoglobulina pesada constante alfa 2 (IGHA2), LYZ, LTF, PRR4, LCN1 y PLA2G2A. Una limitación clave de este estudio fue la exclusión de las queratinas de los datos del estudio para discutir proteínas más vinculadas de forma funcional, sin embargo, esta decisión minimiza el papel de las queratinas en el mantenimiento y la estructura celular en la superficie ocular. Como tal, las proteínas identificadas en este estudio, con la excepción de OPRPN, queratina tipo I citoesqueleto 10 (KRT10) y queratina tipo II citoesqueleto 1 (KRT1), se alinearon con las del proteoma lagrimal humano típico.
Las 10 proteínas lagrimales humanas más abundantes expresadas de manera consistente en todos los grupos (AO y CS) se muestran en la Tabla 2. Este estudio encontró que las proteínas lagrimales más abundantes eran LYZ, LTF e IGHA1. Los niveles altos de expresión de proteínas ( Tabla 2 ) están todos dentro de lo esperado, como lo respalda la literatura. En conjunto, los hallazgos reportados en la Tabla 2 representan un nivel alto de regulación inmunomoduladora y homeostática que ocurre en la superficie ocular de todos los participantes dentro de este estudio, de forma independiente del estado de alergia. La abundancia alta de OPRPN y PRR4 en las lágrimas indica estabilidad y moderación de las funciones de la superficie ocular cuando se expresan junto con LYZ, LTF, IGHA1, LCN1 y PLA2G2A. En las lágrimas, estas proteínas trabajan juntas para formar una red responsable del mantenimiento de una película lagrimal saludable y funcional capaz de eliminar microbios y patógenos transportados por el aire. Esto permite reducir la incidencia de infecciones al tiempo que equilibra la unión de lípidos, proteínas y metabolitos para una variedad de funciones de mantenimiento de la película lagrimal en la superficie ocular.
Para comprender el perfil basal de las lágrimas sanas, se investigó la expresión de proteínas muy abundantes en los CS. En S1 se comparó la expresión diferencial de proteínas entre los CS entre la temporada pico y la temporada baja de alergias. De manera interesante, se puede observar una tendencia general de disminución de la producción de mucina, regulación inflamatoria, estabilidad del ARN y metabolismo celular mediante la expresión alterada de proteínas entre las temporadas pico y las temporadas bajas de alergias. Esto puede deberse a que el clima se vuelve más frío y seco en la temporada baja, lo que requiere una mayor producción de mucina y proteínas antiinflamatorias entre los CS.
4.1 Proteínas expresadas de manera diferencial entre AO y CS
Durante la temporada alta de alergias, los períodos de exposición a alérgenos estacionales, como el polen de gramíneas y las esporas de hongos, son más frecuentes y duran más que durante la temporada baja. En medio de un brote de alergia en la superficie ocular, se desencadena una respuesta inmune por la reexposición a péptidos alérgicos, lo que provoca una vía sintomática de inflamación, enrojecimiento e irritación, seguida de un retorno a la homeostasis. Los hallazgos de este estudio fueron novedosos debido a la importancia de identificar pasos clave adicionales en esta vía, y se teoriza que aumentan su expresión durante un brote de alergia ocular. Es decir, la cicatrización de heridas y la angiogénesis aumentaron su expresión en el proteoma de las lágrimas de los pacientes con AO en comparación con los CS por primera vez, como resultado de la picazón y el frotamiento de los ojos inducidos por la alergia.
Entre los pacientes con AO frente a los CS durante la temporada pico de alergias, se indicó un aumento esperado en la actividad inmunológica por la expresión diferencial de proteínas, como el polipéptido similar a la inmunoglobulina lambda 1 (IGLL1) (Log2 FC = +1.7), la variable de inmunoglobulina lambda 3-21 (IGLV3-21) (Log2 FC = +1.45), CSMD1 (Log2 FC = +1.26), el componente del complemento C9 (C9) (Log2 FC = -1.50) y la moesina (MSN) (Log2 FC = -1.11). Estas proteínas se asocian con la función de las células T y B, el reconocimiento de antígenos y la regulación de la vía del complemento. CSMD1 y C9 pueden vincularse además por medio de la función inmunológica, ya que se demostró que CSMD1 inhibe la vía del complemento, lo que conduce a la disminución de la expresión de C9. En la alergia, se demostró que la activación de la vía del complemento tiene un efecto inmunorregulador mediante la liberación de citocinas y quimiocinas inflamatorias e inmunorreguladoras. Por lo tanto, se teoriza que la inhibición de la vía del complemento afecta la expresión diferencial de otras proteínas inmunes en AO vs. CS durante la temporada alta de alergia, sin embargo, este efecto no se mostró en la temporada baja. De manera controvertida, en la temporada baja, la expresión de las proteínas inmunes IGHG2 (Log2 FC= +1.84), IGHV1–69 (Log2 FC= +1.81), IGLC7 (Log2 FC= +1.57), inmunoglobulina kappa variable 1–8 (IGKV1–8) (Log2 FC= +1.47) y E3 ubiquitina-proteína ligasa (SH3RF) (Log2 FC= +1.13) aumentó de forma significativa en pacientes con AO vs. CS. Esto indica que, a pesar del cambio de la temporada alta a la temporada baja de alergias, todavía se producen cambios en la superficie ocular, como inflamación, enrojecimiento y picazón, como lo sugiere el aumento de la actividad inmunológica.
En este estudio se demostró que la inflamación en la superficie ocular se modifica en la AO vs CS. Como se muestra en la Figura 2 , las proteínas inflamatorias como CSMD1 y dipeptidil peptidasa 1 (CTSC) (Log2 FC= +1.16) aumentaron su expresión en AO vs CS durante la temporada pico de alergias. Se demostró que CSMD1 tiene un papel antiinflamatorio, lo que sugiere que ocurrió una disminución neta de la inflamación entre AO y CS durante la temporada pico de alergias. Esta disminución se destacó aún más por la disminución de la expresión de C9 y ELANE (Log2 FC= -2.01). Sin embargo, el aumento simultáneo de la expresión de la proteína 4 relacionada con Dickkopf (DKK4) (Log2 FC= +1.14), una proteína homeostática clave, puede sugerir que la disminución de la inflamación es indicativa de un retorno a la homeostasis en la superficie ocular después de un brote alérgico. Se demostró de manera previa que DKK4 se expresa de forma principal en la glándula de Meibomio, que es una glándula secretora responsable de mantener la capa lipídica de la superficie ocular para el mantenimiento antimicrobiano y homeostático de la superficie ocular. Un estudio previo que utilizó ensayos basados en células mostró que DKK4 afectó de forma directa las vías de transmisión de señales de Wnt al inhibir la expresión del gen Wnt. La cascada de Wnt es una biovía de regulación y mantenimiento celular, que afecta la homeostasis en las superficies oculares de los adultos a través de la función reducida de la glándula de Meibomio. En los pacientes con AO, esto puede contribuir a la irritación e inflamación a medida que las glándulas de Meibomio luchan por generar lípidos para la lubricación de la superficie ocular en presencia del aumento de expresión de DKK4.
Además, se sugiere en la literatura que CTSG (Log2 FC = -2.14), fibromodulina (FMOD) (Log2 FC = +1.22) y quininógeno-1 (KNG1) (Log2 FC = -1.53) desempeñan un papel clave en la mediación de la inflamación. KNG1 tiene una función similar de regulación inflamatoria a FMOD, pero disminuyó su expresión de forma significativa en este estudio entre AO y CS durante la temporada pico de alergias. Además, CTSG y ELANE tuvieron el mayor Log2 FC negativo de las proteínas expresadas de forma diferencial en AO frente a CS durante la temporada pico de alergias; y ambos se vinculan a la regulación inflamatoria y la eliminación microbiana. CTSC activa ELANE y CTSG para la defensa inmunitaria en los sitios de inflamación, pero éste no es el caso en los hallazgos reportados por este estudio de AO. En conjunto, estos hallazgos pueden indicar una disminución general de la regulación de la inflamación en la superficie ocular después de un brote alérgico. Por lo tanto, la disminución de la expresión de CTSG y KNG1 entre los pacientes con AO puede indicar una disminución de la regulación inflamatoria que se produce en la superficie ocular debido a la exposición prolongada a alérgenos, lo que da lugar a períodos sostenidos de inflamación durante la temporada pico de alergias, en lugar de brotes agudos individuales.
La inflamación a largo plazo se indica además por el aumento de la expresión de vitronectina (VTN) y anexina 3 (ANXA3) observada durante la temporada baja entre los pacientes con AO frente a los CS, con un Log2 FC de +1.09 y +1.22, de forma respectiva. Se demostró que ambas proteínas tienen funciones proinflamatorias, lo que se alinea con el aumento general de la expresión de biomarcadores inmunes en la superficie ocular en AO frente a CS durante la temporada baja. De manera similar, se demostró aquí que MYDGF, una proteína antiinflamatoria, está disminuida en la AO frente a CS (Log2 FC = -2.36) durante la temporada baja. La disminución de la regulación junto con el aumento de la expresión de proteínas inflamatorias indica un aumento neto de la expresión de la inflamación en la superficie ocular durante la temporada baja de alergias entre los pacientes con alergia. Esto es consistente con los de la temporada alta de alergias, lo que indica que los pacientes con AO experimentan un aumento de la inflamación en la superficie ocular de forma independiente de la temporada.
Este hallazgo se respalda además por la disminución de la expresión de la sintetasa de ácido siálico (NANS) (Log2 FC = -1.32) entre AO vs CS durante la temporada baja. NANS media la síntesis de ácido siálico en las células, lo que a su vez bloquea la expresión de citocinas en la superficie ocular; por lo tanto, tiene un efecto antiinflamatorio neto. En el contexto de este estudio, la expresión de NANS disminuyó, lo que indica una desregulación de la expresión de citocinas en la superficie ocular que puede causar un aumento de la inflamación. Esto puede relacionarse con la expresión disminuida de TARS1 en temporada baja (Log2 FC = -1.03), una proteína secretada en respuesta al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y al factor de necrosis tumoral α (TNF-α), citocinas que estimulan la angiogénesis. En última instancia, la angiogénesis puede reducirse en la superficie ocular y la inflamación puede aumentar en AO frente a CS en temporada baja debido a la disminución de NANS y TARS1.
En este estudio se demostró que la inflamación está muy relacionada con la angiogénesis y la vasodilatación, que se manifiestan como enrojecimiento e inflamación en la superficie ocular. La angiogénesis y la vasodilatación se refieren a la formación y expansión de nuevos vasos sanguíneos que ocurren durante una respuesta inmune. La angiogénesis que ocurre en sitios de inflamación e irritación aumenta el flujo sanguíneo al área, lo que permite el transporte de mediadores celulares muy importantes como citocinas, metabolitos y otras moléculas de transmisión de señales para funciones como la cicatrización de heridas. Por lo tanto, las proteínas responsables de la estimulación de la angiogénesis a menudo se superponen con las responsables de la inflamación, como lo demuestra el aumento de la expresión de FMOD (Log2 FC = +1.22) identificada entre AO vs CS en la temporada pico de alergias. La FMOD funciona al activar la vía de transmisión de señales de la fosfoinosítido 3-cinasa (PI3K)/serina/treonina proteína cinasa B (Akt) (vía PI3K/Akt), vinculada de forma previa tanto a la inflamación como a la angiogénesis.
Durante los períodos de inflamación y angiogénesis, desencadenados por la exposición a alérgenos, los pacientes con AO pueden inclinarse al automanejo del picor ocular al frotarse los ojos. Se demostró en la literatura que esto es problemático, sin embargo, hasta ahora no se caracterizó el verdadero alcance de los cambios bioquímicos en la superficie ocular resultantes del frotamiento de los ojos inducido por el picor alérgico. En este estudio, se observaron por primera vez proteínas que indican cambios corneales y cicatrización de heridas resultantes de la AO en las lágrimas humanas de pacientes con AO frente a CS. La cicatrización de heridas es el proceso de reparación que ocurre a nivel celular debido al daño introducido en la superficie ocular. En la AO, esto se ve no sólo por medio de la implicación directa de las proteínas de cicatrización de heridas en este estudio, sino también mediante una expresión mayor de forma significativa de bloques de construcción celulares y proteínas estructurales, como las queratinas. En la superficie ocular, la cicatrización de heridas puede ocurrir como resultado de la inflamación a largo plazo, el frotamiento de los ojos o la exposición a alérgenos. En este estudio, la evidencia que respalda el aumento significativo en la activación de la vía de cicatrización de heridas y los cambios en la estructura celular en la superficie ocular fue abundante, como se reflejó por medio de la expresión diferencial de las proteínas estructurales AMY1A/B/C, KRT76 y las proteínas asociadas a la cicatrización de heridas FMOD, DKK4, KNG1, MSN, Septin-2 (SEPTIN2) y CAPZA1/2.
Las proteínas estructurales y de cicatrización de heridas como MSN, SEPTIN2 y CAPZA1/2 disminuyeron su expresión en las lágrimas de AO vs CS durante la temporada alta de alergias, lo que indica una producción reducida de proteína estructural en general, para compensar el frotamiento de ojos inducido por la alergia. Estos cambios estructurales parecen mantenerse durante la temporada baja, como lo demuestra la expresión diferencial de anexina 11 (ANXA11), ADP/ATP translocasa 1 (ANT1), la proteína tubulina similar a la ligasa de tirosina 12 (TTLL12), reticulón 1 (RTN1), desmocolina-3 (DSC3) y CAPZA 1/2. La proteína con la segunda mayor disminución en la expresión entre AO y CS en la temporada baja, según lo determinado por Log2 FC, es CAPZA 1/2 (Log2 FC= -1.67), que también mostró una disminución significativa en la expresión en la temporada alta de alergias (Log2 FC= -1.03). La figura 3 muestra que la expresión insuficiente de CAPZA 1/2 en las lágrimas de los pacientes con AO se conserva entre las estaciones. CAPZA 1/2 se relacionó con la regulación de la estructura celular y, por lo tanto, puede estar disminuida en los pacientes con AO debido a la desregulación de la estructura celular y la homeostasis causada por la inflamación y el picor asociado a la alergia.
El retorno a la homeostasis después de un brote de alergia es evidente cuando se observa el porcentaje de proteínas expresadas de manera diferencial relacionadas con diversas funciones biológicas. Por lo tanto, es evidente que la proporción de proteínas involucradas en el crecimiento/mantenimiento celular que aumentaron o disminuyeron su expresión es casi igual, lo que indica que las proteínas responsables del mantenimiento celular (y, por lo tanto, de la homeostasis) están algo equilibradas en la superficie ocular en ambas estaciones.
4.2 Discusión sobre los cambios estacionales entre los pacientes con alergia ocular
Los cambios longitudinales que ocurren entre los pacientes con AO entre la temporada alta y la temporada baja de alergias parecen relacionarse en gran medida con la estructura celular y la síntesis de proteínas. El queratocano (KERA) (Log2 FC = -2.53) y la queratina, tipo II citoesqueleto 1b (KRT77) (Log2 FC = -1.42), disminuyeron su expresión de manera muy significativa entre los pacientes con AO en todas las estaciones, lo que indica una transparencia y estructura corneales reducidas durante la temporada alta de alergias. Esto puede deberse al aumento del frotamiento de ojos inducido por la alergia y se respalda por una disminución de manera similar de la expresión de la proteína que contiene el dominio TGc (TGM3) (Log2 FC = -1.05) y su papel en la formación de proteínas. Además, parece haber una homeostasis desregulada entre las personas que padecen alergia entre las estaciones, como lo indica la expresión reducida del miembro 3 de la subfamilia M del canal de cationes de potencial transitorio (TRPM3) (Log2 FC = -1.75) y la proteína que contiene el motivo variable similar a la inmunoglobulina básica (BIVM) (Log2 FC = -1.34). En general, se puede observar que las personas que padecen AO tienen una estructura celular, una capacidad homeostática y una regulación lipídica reducidas en la temporada pico de alergias en comparación con la temporada baja. Esto indica reducciones generales en la función de la superficie ocular y, por lo tanto, una peor salud ocular para las personas que padecen AO durante la temporada pico de alergias.
4.3 Limitaciones
El objetivo principal de este estudio fue investigar los cambios en el proteoma lagrimal humano a lo largo de múltiples estaciones entre pacientes con AO frente a CS. Por lo tanto, las limitaciones del diseño de este estudio implicaron en gran medida la retención de los participantes, la recolección del volumen requerido de muestras de lágrimas de todos los participantes, así como la extracción de calidad suficiente de proteínas para el análisis LC-MS/MS. A los participantes reclutados en la temporada alta de alergias se les pidió que regresaran en la temporada baja. De estos, 17.6 % abandonó debido a conflictos de programación, enfermedad, exposición/aislamiento a/por COVID-19 o no pudieron contactarse. Los participantes con ojos secos, evidenciados por un volumen bajo de lágrimas y un examen con lámpara de hendidura, también se descartaron, lo que redujo aún más el número de participantes en la temporada baja, como se muestra en la Tabla 1. El volumen de lágrimas de los participantes pudo depender en gran medida de la hora del día, la edad y la salud ocular general/factores de estilo de vida, como la exposición diaria a los rayos UV, la contaminación y el tiempo en pantalla, como se demostró antes en la literatura. Los proyectos futuros que busquen validar los hallazgos de este estudio pueden optar por utilizar tipos alternativos de recolección de muestras, como la citología por impresión, que están menos sujetos a variaciones individuales.
Además, las iteraciones futuras de este estudio se beneficiarían de un tamaño mayor de muestra de forma significativa para validar y ampliar los hallazgos de este estudio. En última instancia, debido al tamaño pequeño de la muestra, este estudio no pudo validar más los hallazgos por edad, sexo u otras características individuales. Por lo tanto, este estudio debe tomarse como un estudio piloto exploratorio del impacto de la AO en el proteoma lagrimal humano a lo largo del tiempo.
5. Conclusión
Los hallazgos clave de este estudio indicaron que durante la temporada alta, hubo un aumento general en la inflamación, la actividad inmune y la expresión de proteínas estructurales corneales; y una disminución en la regulación inflamatoria y la actividad antimicrobiana. Las proteínas identificadas en este estudio como expresadas de forma diferencial en la AO durante la temporada alta o la temporada baja de alergias no se reportaron antes por otros estudios comparables. Se demostró que FMOD y KRT76 se expresan de forma diferencial en una condición de ectasia corneal llamada queratocono en la literatura. Contrario a los hallazgos en la literatura sobre el queratocono, se demostró que FMOD aumentó en pacientes con AO durante la temporada alta de alergias en este estudio. Este estudio sugiere que tanto KRT76 como FMOD se vinculan como respuesta a la picazón inducida por alergia, lo que aumenta en última instancia la expresión de proteínas estructurales, la angiogénesis y la cicatrización de heridas de forma potencial como resultado del frotamiento de los ojos en la superficie ocular. Se demostró que CAPZA 1/2 disminuía de manera constante en pacientes con AO en comparación con los CS, de forma independiente de la estación. Los cambios longitudinales en el proteoma lagrimal de los pacientes con AO en comparación con los CS mostraron una diferencia mínima; los que se produjeron en el grupo de control se dieron de forma principal en proteínas relacionadas con la estructura celular. Entre los grupos alérgicos, los cambios estacionales identificaron una expresión más constante de proteínas.
Este estudio tuvo éxito en su intento de identificar diferencias en el proteoma lagrimal humano de pacientes con AO con respecto a la estación en Victoria, Australia, y puede usarse como base para futuros estudios de trastornos de la superficie ocular para la posible identificación de biomarcadores únicos para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. En este artículo, se identificaron una serie de biomarcadores potenciales de AO, donde los más interesantes fueron KRT76, FMOD y CAPZA 1/2. Se utilizarán estudios futuros repetidos en poblaciones más grandes para confirmar y abordar estos hallazgos, con el potencial de proporcionar información muy necesaria sobre los procesos biológicos afectados por la AO y, por lo tanto, cómo el picor y el frotamiento de los ojos inducidos por la alergia afectan la superficie ocular.
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dr. C. Carlos Macouzet Sánchez Profesor
Dra. Silvia Rosario Avilés Vargas Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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