El asma, que se caracteriza por la presencia de tos, disnea y sibilancias como resultado de una inflamación crónica de la vía área, es un trastorno heterogéneo causado por diversos mecanismos fisiopatológicos. El asma es el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales, y respuestas inmunológicas a alérgenos tales como los ácaros del polvo doméstico, el polen y el pelo de animales, son los mecanismos clave subyacentes a la patogenia del asma.
También se cree que los virus desempeñan un papel importante en el desarrollo y la exacerbación del asma. En particular, muchos estudios sobre infecciones por virus respiratorios y respuestas alérgicas reportan que los virus respiratorios se asocian con 80% de los episodios de exacerbación del asma. Entre los diversos virus, se sabe que los rinovirus tienen una gran influencia en el desarrollo de asma; otros virus que se conoce que se asocian con el asma inducida por virus incluyen el virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio (VSR). De manera notable, de acuerdo con la hipótesis de la higiene, se espera que las infecciones frecuentes durante la infancia conduzcan al desarrollo de inmunidad protectora como la inmunidad TH1. Por lo tanto, la exposición a virus comensales o no patogénicos contribuye a reducir el riesgo de desarrollo de asma y alergias. Sin embargo, la presencia o alteraciones de la flora viral comensal de las vías respiratorias y su papel en el desarrollo del asma aún no se comprenden con claridad.
El viroma se refiere a la colección de todos los virus, incluidos los que infectan células eucariotas y procariotas, que residen en y sobre el cuerpo humano y constituyen una gran parte del microbioma humano. Aunque pocos estudios evalúan el viroma debido a su inculturabilidad, estudios recientes de viromas demuestran que la flora viral es un factor importante en la salud y las enfermedades del hospedador. Los miembros desconocidos del viroma se denominan materia viral oscura. Debido a los desafíos técnicos involucrados en los experimentos y análisis de viromas, el viroma no se estudió de manera extensa en comparación con el bacterioma, y sólo unos pocos estudios investigan acerca de las asociaciones entre el viroma y el asma. El primer análisis del viroma realizado en pacientes con asma se llevó a cabo en 2009, el cual evaluó el ADN de comunidades virales en pacientes con y sin fibrosis quística. Además, un estudio de 2018 analizó el viroma y el bacterioma de hisopos nasofaríngeos de 134 niños con asma y reportó que el rinovirus C, el virus Boolarra 1 y el VSR-B eran las especies predominantes. Sin embargo, estos son los únicos reportes de análisis de viromas en pacientes con asma.
Por lo tanto, en este estudio, el objetivo fue identificar y caracterizar el viroma con el esputo inducido recogido de participantes sanos y pacientes con asma. Los hallazgos sugieren que los virus del herpes pueden utilizarse como biomarcadores de la gravedad del asma.
MÉTODOS
Recolección de la muestra
Se reclutaron, en total, 42 pacientes (12 individuos sanos, 15 pacientes con asma no grave y 15 pacientes con asma grave). Este estudio se aprobó por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario Nacional de Seúl (número de aprobación del IRB: 1607-148-778) y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes. El asma se diagnosticó según la presencia de síntomas respiratorios crónicos como tos, esputo, disnea y sibilancias, así como reversibilidad de las vías respiratorias o hiperreactividad de las vías respiratorias (HRA). La reversibilidad de la vía aérea se definió como un aumento en el volumen espiratorio forzado en el primer segundo (VEF1) de >12% y >200 ml cuando se midió 15 minutos después de la inhalación de un agonista β2 de acción corta. La HRA se definió como positiva si una dosis <16 mg/ml de metacolina en una prueba de provocación bronquial indujo una reducción de 20% en el VEF1. El asma grave se definió como una puntuación del cuestionario de control del asma (ACQ) >1.50 o un VEF1 que fuera 40 a 80% del valor predicho a pesar del uso de una inhalación diaria de corticoesteroides a una dosis equivalente a ≥1,000 μg de fluticasona. Todos los pacientes eran no fumadores o exfumadores (<20 paquetes-año). Los individuos que se trataron con antibióticos o que experimentaron exacerbación aguda en los últimos tres meses se excluyeron del estudio.
Se investigaron las características basales de los pacientes enrolados, como las pruebas de función pulmonar, las pruebas cutáneas, la IgE sérica total, la puntuación de la Prueba de Control del Asma (ACT) y los recuentos celulares de sangre periférica. La exacerbación del asma se definió según la Declaración de la Sociedad Americana Torácica/Sociedad Europea Respiratoria que incluye al menos uno de los siguientes: (1) uso sistémico de corticoesteroides durante tres días consecutivos, (2) visita a emergencia o área de hospitalización debido de manera específica al asma, (3) cambio en el VEF1 >20% comparado con el mejor puntaje basal personal.
Construcción de la biblioteca de secuenciación de viromas
Se pretrataron 145 muestras de esputo completo con ditiotreitol para reducir la viscosidad; después se prefiltraron de manera secuencial con filtros de jeringa con tamaños de poro de 5, 2.2 y 0.45 μm; y luego se concentraron con un dispositivo de ultrafiltración Vivaspin® 20 de 20 ml (Sartorius Stedim Biotech, Göttingen,Alemania) equipado con una membrana de polietersulfona de tamaño de poro de 30,000 kDa. El tiempo de centrifugación a 10,000 g varió entre 1 y 2 horas de acuerdo con la muestra. Como consecuencia, se concentraron muestras de alrededor de 6 mL a 12 veces hasta un volumen final <500 μL. Las muestras concentradas se trataron con DNasa I y RNasa A para eliminar el ácido nucleico libre y luego se concentró a 200 μL con un dispositivo de ultrafiltración Vivaspin® 2 de 2 ml (Sartorius Stedim Biotech). Tanto el ADN como el ARN se extrajeron con un QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, Valencia, CA). La primera hebra de cDNA se sintetizó con unSuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) y cebador aleatorio V-N (5′GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNN-3 ′). El ADNc de segunda hebra se sintetizó con un gran fragmento de Klenow (Invitrogen Inc.) y cebadores aleatorios V-N. Para obtener suficiente ADN para la secuenciación, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ADNc sintetizado como plantilla. El cebador V (5′-GTTTCCCAGTCACGATC-3 ′) se utilizó para la PCR. El amplicón de viroma construido se envió a un proveedor comercial de servicios de secuenciación (Chunlab, Seúl, Corea) y secuenció 150 pb lecturas de extremo emparejado con un instrumento HiSeq3000 (Illumina, San Diego, CA). Una descripción detallada de los procedimientos experimentales se da en el Repositorio en Línea de este artículo (disponible en www.jacionline.org) y la Figura 1.
Análisis de la secuencia del viroma
Las lecturas de secuenciación en crudo se procesaron en el siguiente orden, la secuencia de filtrado de calidad, los extremos emparejados fusionados, el filtrado de longitud y el filtrado de secuencias humanas. Las lecturas no humanas resultantes se identificaron con BLASTn (valor de corte e: 10-10, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome) contra una base de datos viral interna que se compone de secuencias descargadas (agosto de 2019) de Genomas Virales del Centro nacional de Información Biotécnica (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/) y secuencias virales no metagenómicas de RefSeq (www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). Entre las secuencias virales identificadas, sólo se seleccionaron aquellas secuencias con cobertura de longitud de alineación ≥50% como secuencias virales verificadas y se utilizaron para análisis posteriores. Además, si la cobertura de alineación era inferior a 90%, la identificación ambigua se marcó agregando “-semejante” al final del nombre del taxón (por ejemplo, similar al coronavirus relacionado con MERS). En última instancia, para confirmar la exactitud de las lecturas virales identificadas como CMV o VEB, las lecturas de secuenciación de una muestra individual se extrajeron y mapearon a ambos genomas de referencia con el banco de trabajo CLC (Qiagen). Se da una descripción detallada en los Métodos en el Repositorio en Línea.
Secuenciación y análisis de bacteriomas
Los ácidos nucleicos bacterianos se extrajeron de 1 mL de esputo inducido con un FastDNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA). La región V3-V4 del gen rRNA 16S se amplificó para construir la biblioteca de secuenciación y la secuenciación de extremos emparejados de 300 pb se realizó con una plataforma Illumina MiSeq v3 (Illumina). La secuenciación de archivos de datos sin procesar se preprocesaron con la fuente de información de bioinformática descrita en los Métodos en el Repositorio en Línea.
Análisis estadístico
La diversidad del viroma beta se evaluó al calcular la distancia de Bray-Curtis con abundancia de especies virales y se trazó con el análisis de coordenadas principales (PCoA) con el paquete de estadística en la versión R 3.5.1. Se evaluó la importancia de la agrupación en la ordenación con el análisis de varianza permutacional multivariada (PERMANOVA) con el programa R. La abundancia relativa transformada de manera logarítmica se retrocedió en los grupos experimentales después de ajustar para el efecto de la edad y la medicación (corticoesteroides orales y antibióticos) con la versión Rex 3.0.3. Todos los valores faltantes para las covariables se reemplazaron por su media. El corticoesteroide inhalado no se incluyó en el ajuste debido a la multicolinealidad ya que tenía una correlación muy alta con la gravedad de la enfermedad (r = 0.947, P < .0001). Se utilizaron la prueba de chi-cuadrada de Pearson para variables categóricas y la prueba t de Student o la prueba exacta de Fisher para variables continuas para analizar las características basales de los sujetos. Se realizó un análisis de correlación para analizar las asociaciones entre la composición del viroma y las variables clínicas. Se aplicaron pruebas de correlación de Pearson para evaluar las relaciones de la puntuación ACT y el VEF1/CVF con la abundancia de los viromas. Las correlaciones entre la abundancia de un virus dada en la lectura del virus total y las variables clínicas se calcularon con el coeficiente de correlación de rango de Spearman y la prueba U de Mann-Whitney. Se utilizó el paquete de programa GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) para el análisis de datos y la preparación de gráficos. Los resultados con P < .05 se consideraron significativos.
RESULTADOS
Características de los pacientes y parámetros clínicos
La Tabla 1 resume las características de los 12 individuos sanos, los 15 pacientes sin asma grave y los 15 pacientes con asma grave inscritos en este estudio. Comparado con los pacientes con asma no grave, aquellos con asma grave tuvieron peores puntuaciones de síntomas (ACT, ACQ), función pulmonar más baja (VEF1, VEF1/capacidad vital forzada [CVF]) y una mayor frecuencia de exacerbaciones agudas.
Estadísticas de secuenciación
La estadística de las lecturas de secuenciación para las muestras individuales a lo largo de las etapas del procesamiento de los datos se presenta en la Tabla E1 en el Repositorio en Línea de este artículo (disponible en www.jacionline.org). En promedio, se produjeron, de manera aproximada, 40 × 106 de lecturas por muestra (Tabla II). Después del procesamiento de los datos, se obtuvieron lecturas filtradas por muestra de alrededor de 13 × 106 de longitud. La longitud de las lecturas depuradas, se filtraron por medio del mapeo del genoma humano y cerca de 0.4 × 106 de las lecturas no humanas por muestras se obtuvieron y sometieron a una búsqueda BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) contra la base interna de datos virales. En promedio, el BLAST identificó 8,400 lecturas por muestra como secuencias virales. Las lecturas virales identificadas se filtraron aún más con la cobertura de alineación de secuencia (umbral ≥50%) y por último se definieron como lecturas virales verificadas. El número de lecturas virales verificadas varió entre muestras (rango: 30-5,300 secuencias). En resumen, las lecturas filtradas por longitud se identificaron como humanas (96.853%), virales (0.063%) y otros (bacterias y desconocidos, 3.083%). Las relaciones de las lecturas virales identificadas (verificadas) representaron 0.051% (0.004%), 0.072% (0.006%) y 0.064% (0,004%) de las secuencias en los grupos de control, asma no grave y asma grave, de manera respectiva; no se encontraron diferencias estadísticas entre los grupos.
Viroma en el esputo inducido
Las estructuras del viroma en los grupos sanos, con asma no grave y con asma grave se distinguieron de manera clara, de acuerdo con el análisis de diversidad beta (P < .05) (Fig. 2a).
La descripción completa de la composición del viroma de muestras individuales se proporciona en la Tabla E2 el Repositorio en Línea de este artículo (disponible en www.jacionline.org) y la Fig. 3a y los promedios de grupo se resumen en la Fig. 2c. Entre todos los virus en la muestra total, los virus de procariotas son los más abundantes con 62.0% ± 4.5%, seguidos de los herpesvirus en 35.7% ± 4.2%. Los herpesvirus representaron 13.4% ± 5.2% de los virus en los individuos sanos y 44.6% ± 4.6% en los pacientes con asma. Cuando se analiza en términos de los grupos de herpesvirus, el virus del herpes simple 1 (VHS-1; 3.1% ± 1.0%), el citomegalovirus (CMV; 24.5% ± 3.3%) y el virus de Epstein Barr (VEB, 16.9% ± 3.5%) de los niveles alfa, beta y subfamilias gamma, de manera respectiva, representaron la mayoría de todos los herpesvirus en los pacientes con asma. También se detectaron otros virus eucariotas como Betapapillomavirus, pero no mostraron diferencias entre los grupos.
Para verificar la precisión de la identificación de CMV y VEB, las lecturas identificadas de muestras individuales se extrajeron y se alinearon con los genomas del virus de referencia (Fig. E1 el Repositorio en Línea de este artículo en www.jacionline.org). Como resultado, las lecturas identificadas como CMV se mapearon sólo en el genoma del CMV pero no en el genoma del VEB, y viceversa. Los resultados demostraron la precisión de la identificación de la secuencia viral y también indicaron la presencia de grandes cantidades de virus del herpes en las muestras respiratorias lo que muestra cobertura alta y profundidad de mapeo del genoma.
La descripción completa de la composición de los fagos de las muestras individuales se proporciona en la Tabla E3 el Repositorio en Línea de este artículo (disponible en www.jacionline.org). El bacteriófago fue la mayoría del viroma en el grupo sano, pero tendió a la disminución en el grupo de asma en el orden de los sanos (86.4% ± 5.3%), asma no grave (70.3% ± 4.5%) y grupo de asma grave (34.1% ± 5.8%). Entre los 20 bacteriófagos identificados en las muestras, el fago de Streptococcus fue el virus más abundante, lo que forma un promedio de 25.9% ± 5.0% de la muestra total (Fig. 2c). La abundancia del fago Streptococcus fue menor de manera significativa en el grupo de asma (11.1% ± 3.2% en no graves, 5.5% ± 2.7% en graves) que en el grupo de control (70.0% ± 7.2%) (Tabla E3). Mientras que el fago de Streptococcus disminuyó en el grupo de asma, el fago de Klebsiella y los fagos de Escherichia aumentaron y se convirtieron en los bacteriófagos más abundantes en los grupos de asma no grave y grave, de manera respectiva.
Bacterioma en el esputo inducido
Las estructuras del bacterioma de los grupos sanos, con asma no grave y con asma grave no se distinguieron de acuerdo con los análisis de diversidad beta (Fig. 2b). Las bacterias más abundantes eran especies de Streptococcus (26.3%; Fig. 2d). Otras bacterias dominantes que constituyen 5% o más del total de las muestras son, en orden descendente, Prevotella (16.0%), Neisseria (12.8%), Veillonella (8.5%) y Haemophilus (7.6%), seguidas de Porphyromonas, Fusobacterium, Leptotrichia, Actinomyces y Alloprevotella. En contraste con el análisis del viroma, ninguna bacteria mostró diferencias en abundancia entre los grupos (pruebas de Kruskal-Wallis, análisis discriminante lineal análisis del tamaño del efecto).
Los resultados de los análisis de bacteriomas y viromas de fagos fueron inconsistentes. Mientras que el análisis del viroma reveló diferencias en la abundancia de los fagos de Streptococcus, Escherichia y Klebsiella dependientes de la presencia o la ausencia y la gravedad del asma, el análisis de bacteriomas mostró abundancias similares para estas 3 bacterias sin diferencias entre los grupos.
Tasa de detección de virus individuales entre las muestras de esputo
Para conocer la tasa de aparición de un virus específico entre la población, se calculó la proporción de muestras detectadas por virus para cada grupo (Fig. 3b). Los beta herpesvirus humanos y gamma herpesvirus humanos, principalmente CMV y VEB, de manera respectiva, se detectaron en 58% de las muestras de esputo de individuos sanos, mientras que de manera relativa, se identificaron aún más en muestras de esputo de pacientes con asma en el orden de no graves (60-87%) y asma grave (93-100%). Por el contrario, el fago de Streptococcus se detectó en 100% de los individuos sanos y se encuentra con menos frecuencia en pacientes con asma no grave (60%), baja a 47% en aquellos con asma grave.
Asociación entre factores clínicos y viroma pulmonar
El análisis del viroma mostró que los virus del herpes se asocian con la gravedad del asma; por lo tanto, se exploró más este grupo de virus de acuerdo con factores clínicos. Las proporciones de los herpesvirus beta humanos y los herpesvirus gamma humanos, principalmente CMV y VEB, de manera respectiva, aumentaron de modo significativo con la gravedad del asma (Fig. 4a). Cabe destacar que la abundancia de CMV en el grupo sano (5.4% ± 2.5%) fue diferente de manera significativa a aquellos de los grupos de asma no grave y grave (18.1% ± 3.8% y 31.0% ± 5.1%, de manera respectiva; P = .009). De manera similar, el VEB tuvo diferentes abundancias entre los tres grupos (P = .047) en el orden de grupos sanos (7.1% ± 3.1%), asma no grave (9.3% ± 4.9%) y asma grave (24.6% ± 4.3%). Además, la abundancia de CMV y bacteriófagos, afectó la aparición de exacerbaciones agudas durante el período de un año en pacientes con asma (n = 30). La tasa de exacerbación positiva fue diferente entre los grupos alto (≥ percentil 50) y bajo (< percentil 50) de CMV o bacteriófagos (Fig. 4b). En términos de los parámetros subjetivos del asma, el CMV y el VEB revelaron correlaciones negativas, de manera moderada, con las puntuaciones de ACT que reflejan mayor control del asma (n = 30, P = .031 y .072, de manera respectiva, Fig. 4c). Además, la abundancia de CMV se asoció de manera negativa con la relación VEF1/CVF, un marcador de obstrucción de las vías respiratorias (n = 42, Figura 4d). El uso de corticoesteroides o antibióticos orales no mostró correlación con ninguno de los virus identificados en este estudio (Tabla E4 Repositorio en Línea de este artículo en www.jacionline.org). Las abundancias del CMV y el VEB en las muestras no se correlacionaron (Fig. E2), lo que indica la independencia de los dos virus del herpes en el pulmón. A diferencia del CMV y el VEB, los herpesvirus alfa humanos (HVS-1) no mostraron una asociación con alguno de los factores clínicos.
En contraste con el CMV y el VEB, las proporciones de bacteriófagos disminuyeron con la gravedad del asma (P < .001) y la exacerbación (Fig. 4a-b). Además, tuvo una correlación positiva con el ACT y la relación VEF1/CVF (P = .003 y < .001, de manera respectiva) (Fig. 4c-d). Al analizar el bacteriófago por huésped, se encontró que el fago de Streptococcus era responsable de esas correlaciones fago-factor clínico. La abundancia del fago de Streptococcus disminuyó de manera significativa con la gravedad de la enfermedad (P < .003) y la exacerbación (Fig. E3a-b). La proporción del fago de Streptococcus se correlacionó de manera positiva con la puntuación ACT y el VEF1/CVF (P =.005 y < .001, de manera respectiva) (Fig. E3c-d). Los otros fagos, incluidos los fagos de Klebsiella y Escherichia no mostraron ninguna correlación significativa con las características clínicas.
DISCUSION
En este estudio, se demostró por primera vez que las especies y la composición de virus difiere mucho según la presencia o la ausencia de asma. En particular, se encontró que la abundancia de los herpesvirus humanos beta y gamma se asocia con los síntomas de asma.
Los herpesvirus son virus de ADN que infectan a los seres humanos con una latencia de por vida. Existen ocho especies de herpesvirus humanos (HVH). En este estudio, se identificaron HVH-1 (HVS-1), un alfa-herpesvirus; HVH-5 (CMV) y HVH-6A/B, beta-herpesvirus; y HVH-4 (VEB), un gamma-herpesvirus. Los herpesvirus, en particular CMV y VEB, se detectan de manera común en la población en general. Se sabe que la tasa de seropositividad al VEB en la población general es >90%. La seroprevalencia global de CMV se estima en 83% con una variación regional de 66-90%. También se encontró una proporción alta (58%) de ambos virus en individuos sanos, aunque la tasa positiva basada en el viroma fue menor que la tasa basada en las pruebas serológicas debido a la diferencia técnica. Se cree que la inconsistencia de las tasas positivas entre reportes anteriores y este reporte se debe a que la tasa de seropositividad incluye el historial de infecciones previas, pero el análisis del viroma detecta la presencia actual de ADN viral, lo que puede reflejar la reactivación del herpes virus latente. Por lo tanto, los herpesvirus se consideran virus latentes ubicuos con importancia menor de manera relativa, que otros virus respiratorios patógenos. Sin embargo, hay pocos reportes sobre la asociación entre herpesvirus y el asma. Por ejemplo, sólo tres de los 63 artículos sobre la exacerbación del asma y los virus reportan que el HVS-1 y el CMV son los virus principales. Esto puede atribuirse a la subestimación de la importancia de los herpes virus presentes en las vías respiratorias y los estudios convencionales se centraron de manera principal en virus patógenos conocidos en el pasado.
Ya que los estudios sobre los viromas se acumularon de manera reciente, muchos estudios relacionados con el virus del herpes también se llevan a cabo. Es importante destacar que el ADN del CMV se encontró en la sangre de pacientes adultos con asma, y su número de copias se correlacionó con un mayor riesgo de asma. El número de copias de ADN del CMV fue mayor de manera relativa en el líquido de lavado broncoalveolar de 111 pacientes pediátricos con asma que en niños sanos. De acuerdo con esto, varios estudios reportaron que una infección por herpesvirus causa cambios patológicos en los pulmones y conduce a enfermedad respiratoria crónica. Aquí se encontró que la gravedad y la exacerbación del asma aumentaron a medida que incrementaba la abundancia de herpesvirus humanos (de manera particular CMV y VEB). Además, el CMV y el VEB mostraron correlaciones inversas significativas con las puntuaciones ACT y VEF1/CVF, lo que sugiere que pueden relacionarse con el empeoramiento de los síntomas y la disminución de la función pulmonar. Se presume que la reactivación de los herpesvirus latentes puede relacionarse con diversas desregulaciones inmunitarias patológicas o medicación en el pulmón asmático, aunque los mecanismos moleculares exactos que conducen a la reactivación no pueden explicarse aquí.
La correlación entre el CMV y la gravedad del asma parece surgir de la relación entre los HVH y el sistema inmunológico. Varios estudios demostraron una asociación entre los virus del herpes y el sistema inmunológico, incluidas sus funciones en la producción del interferón-α mediante el receptor tipo toll 9 y la regulación de citocinas asociadas con la interleucina-10. Además, varios estudios poblacionales sugieren que el asma puede ser un factor de riesgo para el herpes zóster, infección por el alfa-herpesvirus 3 humano. A pesar de la relación entre los virus del herpes y el asma puede asociarse con cambios en el sistema inmunológico, la relación causal entre los virus del herpes y las enfermedades respiratorias no se dilucidaron; por lo tanto, se necesitan más estudios sobre este tema.
En este estudio, la secuenciación de escopeta y la secuenciación de amplicones de ARNr 16s se realizaron en la misma muestra, y se realizaron análisis correlacionales entre la información del viroma y el bacterioma. El análisis del viroma mostró una abundancia muy alta de fagos de Streptococcus en el grupo control (70.0%) y de manera notable menor abundancia en el grupo de asma, mientras que el análisis del bacterioma no reveló diferencias en la abundancia de Streptococcus entre los grupos. El análisis de correlación tampoco encontró una correlación significativa entre la abundancia de fagos de Streptococcus en el viroma y la de Streptococcus en el bacterioma. Sin embargo, la abundancia del bacteriófago puede parecer menor de manera relativa en los pacientes con asma que en los individuos sanos debido al gran aumento en la abundancia de virus eucariotas en los pacientes con asma en lugar de que se deba a una reducción real en la abundancia de los bacteriófagos. Un reporte previo sobre el viroma respiratorio en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) señaló una reducción en la abundancia de bacteriófagos en los hisopos nasofaríngeos de pacientes con EPOC, similar a los resultados de este estudio que demuestran una abundancia reducida de bacteriófagos en pacientes con asma.
Los virus, más que las bacterias, constituyen la mayor proporción de la microbiota humana. Por lo tanto, en diversas enfermedades y estados de salud, el viroma atrae atención considerable. Sin embargo, la investigación de viromas se limita debido a los desafíos técnicos, incluida la biomasa baja y la falta de marcadores moleculares universales y bases de datos de virus estandarizadas. Para superar el problema de la biomasa baja en muestras respiratorias, que tienen cargas virales bajas, las partículas virales de manera común se recolectan mediante la centrifugación con un gradiente de densidad de cloruro de cesio. Sin embargo, lograr un uso generalizado de este método en el entorno de diagnóstico es difícil porque requiere un dominio técnico alto. Para abordar este problema, se utilizó un enfoque sencillo y conveniente, con tubos de concentración de muestra disponibles de manera comercial (2 y 20 ml tubos) para recoger las partículas virales. La proporción de la secuencia viral entre las secuencias no humanas obtenidas mediante este enfoque fue 2.79% (rango de 0.04-30.16% dependiente de las muestras cuando se utilizó la base de datos de virus NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/] para la identificación de secuencias; datos no mostrados). Esta proporción viral es equivalente al valor observado en otro estudio de viroma de esputo que utilizó ultracentrifugación de cloruro de cesio (3.34%). Así, el enfoque de miniconcentrador desarrollado de manera reciente puede permitir la estandarización y aumentar la reproducibilidad de procedimientos experimentales para el análisis del viroma.
La investigación del viroma de las vías respiratorias enfrenta desafíos adicionales debido a las dificultades en el muestreo del viroma de las vías respiratorias en comparación con el del viroma intestinal. A pesar de realizar el suficiente lavado bucal antes de inducir el esputo, la contaminación por las vías respiratorias superiores y la saliva pueden ocurrir en el proceso de recolección de las muestras. Incluso los líquidos de los lavados broncoalveolares, que se sabe que tienen una probabilidad baja de manera relativa de contaminación, no están libres de ésta. Sin embargo, de acuerdo con reportes anteriores, la señal que se correlaciona de manera constante con los índices de enfermedad pulmonar no se oculta por completo a pesar del ruido introducido por la contaminación de la parte superior vías respiratorias. En consecuencia, se cree que la correlación asma-virus observada en este estudio es significativa a pesar del riesgo de contaminación de las vías respiratorias superiores.
La posible subestimación de los virus de ARN es una limitación de este estudio. La proporción de virus eucariotas, excluidos los bacteriófagos, fue 38.0%, de los cuales la mayoría son virus de ADN, mientras que los virus de ARN representaron menos de 1%. La abundancia baja de virus ARN se debe de manera probable a la eliminación excesiva de virus de ARN durante el aislamiento del virus y los procesos de extracción de ácido nucleico, como se reportó de manera previa. En particular, el uso de RNasa para eliminar los ARN libres afectó la fracción de ARN del viroma. Los estudios de bacteriomas a menudo tienen tamaños grandes de muestra, el número bajo de muestras de viroma es también una limitación. Para descubrir de manera completa la materia oscura viral en el asma, se requieren de más estudios con tamaños grandes de muestra y una secuenciación viral reforzada de ARN. La otra limitación de este estudio es que la contribución de los corticoesteroides inhalados sobre la abundancia de los virus comensales no pudo analizarse de forma independiente con la gravedad de la enfermedad debido a la multicolinealidad de estos dos factores. Se requieren análisis adicionales, como el análisis de datos longitudinales que mide el viroma antes/después de la medicación para ajustar el efecto del corticoesteroide inhalado.
Conclusiones
Los hallazgos de estudio revelaron una asociación significativa entre el viroma y la variable clínica de la gravedad del asma, lo que sugiere que los virus del herpes y los bacteriófagos de las vías respiratorias pueden tener posibles aplicaciones futuras como un biomarcador del asma.
Lung virome: New potential biomarkers for asthma severity and exacerbation
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Marisela Hernández Robles Profesor
Dra. Ana Karen Chávez Ruíz Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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