Journal Club del CRAIC: La eliminación viral y la evolución de SARS-CoV-2 varía por tipo y gravedad de inmunodeficiencia

INTRODUCCIÓN

Las vacunas contra la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) transformaron el panorama de la pandemia de COVID-19 al ofrecer una protección sustancial contra la adquisición de infecciones y enfermedades graves, y en última instancia evitaron decenas de millones de muertes. De manera desafortunada, no todas las personas responden bien a la vacunación, y las personas inmunodeprimidas pueden tener respuestas deficientes a la vacuna y peores resultados relacionados con COVID-19. Cada nueva variante del síndrome respiratorio agudo grave por coronavirus-2 (SARS-CoV-2) conlleva riesgos de resistencia a los tratamientos actuales, en particular terapias con anticuerpos dirigidos, resistencia a la inmunidad inducida por la vacuna y adquirida de forma natural y mayor transmisibilidad. Se observó que las personas inmunodeprimidas albergan el virus SARS-CoV-2 detectable durante más tiempo que las personas no inmunodeprimidas. Estos individuos representan un origen potencial de nuevas variantes del SARS-CoV-2, ya que la infección persistente se asocia con una evolución viral acelerada.

Sin embargo, el estado inmunodeprimido se compone de una variedad de condiciones y defectos inmunológicos. Aquellos defectos que predisponen a un individuo a la COVID-19 persistente permanecen poco caracterizados. Aunque hubo una serie de reportes de casos de COVID-19 persistente en individuos inmunodeprimidos que muestran una eliminación viral prolongada, enfermedad persistente y diversidad genética virológica intrahuésped, aún existe la necesidad de estudios a mayor escala con una caracterización virológica e inmunológica integral para dilucidar mejor los factores inmunológicos de riesgo y los mecanismos de la infección persistente. Con este fin, se presenta aquí un análisis virológico e inmunológico longitudinal detallado de una cohorte de participantes inmunodeprimidos y no inmunodeprimidos con infección por SARS-CoV-2 con el objetivo de caracterizar el espectro virológico de la infección persistente y explorar los determinantes inmunológicos que predisponen a su aparición.

RESULTADOS

Características de los pacientes

Se incluyeron en este análisis cincuenta y seis participantes inmunodeprimidos y 184 participantes no inmunodeprimidos inscritos en el estudio de cohorte longitudinal POSITIVES. La información demográfica y las características virales clave se muestran en la Tabla 1. Los participantes inmunodeprimidos eran mayores de forma significativa que los controles no inmunodeprimidos (mediana de 55 versus 46 años, P = 0.001) y tenían más probabilidades de recibir anticuerpos monoclonales (mAb) o tratamiento antiviral contra el SARS-CoV-2. Los dos grupos tenían perfiles de sexo, raza y etnia comparables y un tiempo promedio similar desde el inicio de los síntomas o la primera prueba positiva de COVID-19 hasta la inscripción (5 versus 4 días). Además, se subdividió a los participantes inmunodeprimidos en los grupos hematológico-oncológico grave/trasplante (HOG-T, n = 12), autoinmune grave/deficiencia de células B (AIG, n = 13) y no grave (NG, n = 31) (Tablas S1 y S2 para una categorización detallada). Tres participantes murieron debido a COVID-19 grave o complicaciones relacionadas con COVID-19, todos ellos en los subgrupos de inmunodeprimidos graves (HOG-T, n = 2 y AIG, n = 1). La mediana de la duración del seguimiento para los grupos inmunodeprimidos y no inmunodeprimidos fue 18 y 16.5 días (P < 0.001, Tabla 1 ). Ocho participantes no inmunodeprimidos tuvieron una duración de seguimiento inferior a 10 días. Setenta y nueve por ciento de los participantes inmunodeprimidos y 88 % de los no inmunodeprimidos eliminaron el ARN viral del SARS-CoV-2 nasal al final del período de seguimiento. La duración media desde la última vacuna fue de 154 días entre los 213 participantes que se vacunaron y pocos participantes (12 %) recibieron refuerzos basados ​​en Ómicron. Ciento cuarenta y siete participantes aceptaron proporcionar muestras de sangre; el tiempo medio hasta la extracción de sangre 1 (poco después del ingreso al estudio) fue de 7 días después del inicio de los síntomas o la primera prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) positiva y el tiempo medio hasta la extracción de sangre 2 fue de 20 días después del inicio de los síntomas o la primera prueba de PCR positiva.

Se observó una eliminación viral retardada en los participantes de la cohorte HOG-T

En primer lugar, se propuso caracterizar la dinámica viral en el tracto respiratorio superior en participantes con diferentes categorías de afecciones inmunodeprimidas. Los participantes inmunodeprimidos y no inmunodeprimidos tuvieron cargas máximas similares de ARN viral (5.1, 5.1, 4.9 y 5.7 log10 copias de SARS-CoV-2/ml en los grupos HOG-T, AIG, NG y no inmunodeprimidos, P = 0.5). Sin embargo, las tasas de decaimiento del ARN viral nasal fueron diferentes entre las categorías de inmunocompromiso, donde el grupo HOG-T demostró una eliminación viral más lenta en comparación con los otros grupos (Fig. 1, A y B). El tiempo mediano para la eliminación del ARN viral nasal en el grupo HOG-T fue 72 días [intervalo de confianza (IC) de 95 %: 5, no disponible (NA)] en comparación con 10 (7, NA) días para el grupo AIG, 12 (9, 17) días para el grupo NG y 13 (13, 15) días para el grupo no inmunocomprometido (rango logarítmico, P = 0.002; Fig. 1B). De manera similar, el grupo HOG-T experimentó un retraso en la eliminación del virus cultivable (Fig. 1, C y D). El tiempo mediano para la eliminación del cultivo viral en el grupo HOG-T fue 40 días (IC de 95 %: 5, NA) en comparación con 6.5 (5, NA) días para el grupo AIG, 6 días (5, 7) para el grupo NG, y 7 días (6, 7) para el grupo no inmunocomprometido (rango logarítmico, P < 0.001; Fig. 1D). A los 30 días o más desde el inicio de los síntomas o la primera prueba positiva, 50 %, 15 % y 6.5 % de los participantes de los grupos HOG-T, AIG y NG tenían ARN viral detectable en comparación con 0 % en el grupo no inmunocomprometido (P < 0.0001; Fig. S1A). Además,  50 % de los participantes de HOG-T y 8.3 % de los participantes de AIG aún tenían virus cultivables en comparación con 0 % en los grupos NG y no inmunocomprometidos después de 30 días (P < 0.0001; Fig. S1B). Además, 50 % de los participantes HOG-T y 8.3 % de los participantes SA todavía tenían virus cultivables, en comparación con 0 % en los grupos NG y no inmunodeprimidos después de 30 días (P < 0.0001, Fig. S1B ). La dinámica viral de los participantes que no eliminaron el ARN viral después de 30 días (Tabla S3) se muestra en la Fig. S1C. En comparación con el grupo no inmunodeprimido, el grupo HOG-T se asoció con una eliminación tardía del ARN viral (cociente ajustado de riesgo [aHR] para la eliminación viral, 0.29; IC de 95 %: 0.11-0.74; P = 0.009) y una eliminación del virus cultivable (aHR 0.27 para la eliminación viral, IC de 95 %: 0.12-0.62; P = 0.002), después de ajustar la demografía, el número de vacunaciones y el uso de antivirales (Tabla 2). Para validar este hallazgo, también se realizó un análisis del tiempo restringido promedio de supervivencia (TRPS) que no requiere suposiciones de riesgos proporcionales. De manera similar, el grupo HOG-T requirió un tiempo más largo para eliminar el ARN viral nasal del SARS-CoV-2 (cociente ajustado TRPS 3.09, IC de 95 % 2.16-4.40, P < 0.0001) y el virus cultivable (cociente ajustado TRPS 3.33, IC de 95 % 2.16-5.14, P < 0.0001) (Tabla 2).

Se observó una mayor evolución del SARS-CoV-2 y diversidad genética en participantes inmunodeprimidos

Se utilizó un enfoque de secuenciación de próxima generación específico del gen para cuantificar el número de variantes únicas de un solo nucleótido intrahuésped (VUSNi) en el gen S, que codifica la proteína de la espícula, presentes en una frecuencia >3 % dentro de cada muestra. Este análisis se limitó a los participantes con un genoma viral disponible tanto al inicio como en un mínimo de un punto temporal de seguimiento. Los participantes más inmunodeprimidos (HOG-T y AIG) albergaron un mayor número de VUSNi emergentes a lo largo del tiempo en comparación con los participantes del grupo NG y no inmunodeprimidos (Fig. 2A). Para evaluar la diversidad viral, se calculó la distancia promedio por pares tanto a nivel de nucleótido como de aminoácido por día. La distancia media de pares de nucleótidos por día fue mayor de forma significativa en los grupos inmunodeprimidos graves (HOG-T y AIG) en comparación con los grupos no graves (P = 0.001 con la prueba de Dunn con ajuste de Benjamini-Hochberg) o no inmunodeprimidos (P < 0.001 con la prueba de Dunn con ajuste de Benjamini-Hochberg, Fig. 2B). Se obtuvieron resultados similares cuando se calcularon las distancias medias de pares para los aminoácidos (Fig. S2A). Entre los participantes con secuencias longitudinales, 39 % de los participantes en el grupo inmunodeprimido frente 12 % en el grupo no inmunodeprimido tenían evidencia de cambios de nucleótidos virales (prueba exacta de Fisher P < 0.001, Fig. 2C y Fig. S2B). Estos cambios de nucleótidos se distribuyeron a lo largo de toda la longitud del gen S (Fig. S2B).

Las personas inmunodeprimidas tenían un riesgo mayor de resistencia a la terapia con mAb anti-SARS-CoV-2

Se realizó un análisis de secuenciación profunda del gen S para evaluar la dinámica de la aparición de mutaciones en presencia de tratamiento con mAb, ya que reportes anteriores demostraron evidencia de la aparición de resistencia a mAb tanto en participantes inmunodeprimidos como no inmunodeprimidos. En total, 34 participantes en diferentes grupos de estudio recibieron terapia con mAb, 10 en HOG-T, 9 en AIG, 5 en NG y 10 en grupos no inmunodeprimidos (Tabla S4). De estos, se pudo evaluar el riesgo de aparición de resistencia en un subconjunto de participantes para quienes las secuencias estaban disponibles tanto al inicio como al menos en un punto temporal de seguimiento. Cinco de nueve (56 %) participantes inmunodeprimidos (HOG-T y AIG) desarrollaron mutaciones de resistencia específicas al mAb (Fig. 2D y E). Ésta fue una tasa más alta que la encontrada en los grupos no graves o no inmunocomprometidos (0/11 [0 %] combinados, P exacta de Fisher = 0.008; Fig. 2D). Además, una duración mayor de la infección se asoció con una acumulación mayor de mutaciones (Fig. S2C).

La infección provocó respuestas humorales subóptimas en participantes con un sistema inmunitario comprometido

A continuación, se caracterizó la respuesta de anticuerpos en participantes inmunodeprimidos y no inmunodeprimidos. En los participantes con muestras disponibles de suero (n = 94), incluidos los que recibieron anticuerpos monoclonales de forma previa, no se encontraron diferencias en los títulos de anticuerpos neutralizantes (nAb) entre los diferentes grupos inmunodeprimidos y no inmunodeprimidos en los puntos tempranos y tardíos de tiempo de muestreo, aunque este análisis puede ser limitado debido a los individuos que recibieron una infusión de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 antes de la recolección de la muestra (ya sea profilaxis terapéutica o preexposición) (Fig. 3A y B). El grupo no inmunodeprimido exhibió un aumento en los títulos de nAb antiancestrales y antivariantes específicos de la proteína espiga durante el seguimiento, mientras que no se observó un aumento en los títulos de anticuerpos en los grupos inmunodeprimidos (Fig. 3A y B). Sin embargo, después de excluir a los individuos con exposición a terapias con mAb, el grupo inmunodeprimido no grave demostró un aumento moderado en los títulos de nAb específicos a la proteína espiga, mientras que el grupo inmunodeprimido grave no mostró cambios; el grupo no inmunodeprimido demostró el mayor aumento en los títulos de nAb, que se estabilizaron entre los días 25 y 30 (Fig. 3C y D).

En un modelo de ecuación generalizada de estimación (GEE) multivariante, el título de nAb antiespiga ancestral en el grupo grave (HOG-T y AIG) fue 5 veces menor que el grupo no inmunodeprimido (grave frente a no inmunodeprimido, 0.18 veces, IC de 95 % 0.05-0.60, Fig. S3A). De manera similar, el título de nAb antiespiga variante en el grupo grave fue 12 veces menor (grave frente a no inmunodeprimido, 0.08 veces, IC de 95 % 0.03-0.22, Fig. S3B ). El estado inmunodeprimido no grave no se asoció con diferencias en los cambios de nAb en comparación con el grupo no inmunodeprimido. En toda la cohorte, cada dosis de vacuna previa a la infección por SARS-CoV-2 se asoció con un aumento de 1.70 veces (IC de 95 %: 1.25 a 2.30) y 1.35 veces (IC de 95 %: 1.01 a 1.79) en los títulos de anticuerpos antiancestral y antivariante específicos a la proteína espiga, de forma respectiva (Fig. S3A y B).También se evaluaron los títulos de anticuerpos de unión contra la proteína de la nucleocápside debido a que este ensayo no se afecta por el uso de anticuerpos monoclonales. De manera similar a los datos de nAb, los individuos en los subgrupos HOG-T y AIG tuvieron aumentos atenuados en el desarrollo de anticuerpos (Ab) de unión a la nucleocápside desde el punto de tiempo agudo hasta el punto de tiempo posterior, y títulos más bajos de Ab de unión en comparación con los grupos NG y no inmunodeprimidos (Fig. 3E). De forma longitudinal, los títulos de Ab de unión en los grupos NG y no inmunodeprimidos se estabilizaron alrededor del día 20 a 25 a una concentración de 1 a 1.5 log10 UI/ml, mientras que los grupos HOG-T y AIG exhibieron un desarrollo retardado de Ab de unión a la nucleocápside a una concentración por debajo de 1 log10 UI/ml después del día 50 ( Fig. 3F ).

En el grupo HOG-T se observaron respuestas disminuidas de las células T a la proteína espiga

En un estudio reciente, Apostolidis et al. demostraron respuestas elevadas de células T CD8+ específicas a la proteína espiga en participantes vacunados con ARNm de COVID-19 con esclerosis múltiple que recibieron tratamiento anti-CD20 en comparación con controles sanos. De manera similar, Zonozi et al. observaron hallazgos similares de secreción elevada de IFN-γ y proliferación de células T CD8+ tras la estimulación del grupo de péptidos espiga en individuos deficientes en células B (ya sea tratados con rituximab o con inmunodeficiencia variable común) en comparación con aquellos sin deficiencia de células B. Sin embargo, aún se desconoce en gran medida si diferentes tipos y grados de inmunosupresión se asocian con un inmunofenotipo similar de células T. Con este fin, se perfiló la función efectora de las células T con un punto inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISpot) y un ensayo de proliferación específico al antígeno para un grupo seleccionado de participantes en función de la disponibilidad de la muestra. El grupo no inmunocomprometido presentó menores unidades de producción de interferón gamma (IFN-γ) por millón de células tras la estimulación en ambos muestreos de sangre (infección aguda de 0 a 14 días, y postaguda de 15 a 60 días después del inicio de los síntomas o del primer test positivo de COVID-19), en comparación con los grupos NG y AIG, en respuesta tanto a los péptidos de espiga ancestral como a los específicos de las variantes. (Fig. 4A). Los individuos del grupo AIG tendieron a tener las frecuencias más altas de células T CD4+ y CD8  proliferativas tras la estimulación del grupo de péptidos de espiga, en especial en comparación con los individuos HOG-T y no inmunodeprimidos (Fig. 4B y C , Fig. S4). En el análisis longitudinal, el grupo HOG-T mostró una proliferación deficiente de células T CD4+ y CD8+, a pesar de una secreción de IFN-γ comparable en comparación con el grupo no inmunodeprimido (Fig. 4D). Por el contrario, el grupo AIG mostró una proliferación robusta de células T a lo largo del tiempo en respuesta a los grupos de péptidos de espiga tanto ancestrales como específicos de la variante en comparación con todos los demás grupos. Además, se realizó un análisis emparejado por puntaje de propensión para comparar las respuestas de las células T alrededor del momento de entrada al estudio (punto temporal 1) en los participantes con eliminación viral temprana versus tardía (definida como eliminación del ARN viral del SARS-CoV-2 más allá del día 30 o ARN viral positivo más allá del día 10 y luego perdida para el seguimiento) en los grupos inmunocomprometidos. En 6 participantes con eliminación viral tardía emparejados con 18 participantes con eliminación temprana (Fig. S5A) en función de los títulos de anticuerpos de unión y la gravedad del inmunocompromiso, se observaron títulos de anticuerpos de unión comparables al ingresar al estudio (Fig. S5B, P = 0.3). La respuesta de ELISpot fue comparable entre los grupos temprano y tardío (Fig. S5Cy D). Sin embargo, la proliferación de células T CD4+ y CD8+ fue mayor en el grupo de aclaramiento temprano al inicio del estudio (P < 0.05 excepto en el panel H, Fig. S5E a H). No se pudieron evaluar las diferencias entre los grupos en el segundo momento de extracción de sangre debido a los números limitados.

DISCUSIÓN

Comprender las características del control viral e inmune de la infección por COVID-19 es crucial para la capacidad de cuidar a los individuos inmunocomprometidos, que son los de mayor riesgo de infección persistente y grave. Además, esto puede guiar las intervenciones en salud pública y arrojar luz sobre el desarrollo de vacunas que protejan a los inmunocomprometidos. En este estudio, se realizó una evaluación virológica e inmunológica profunda de una cohorte de individuos inmunocomprometidos y no inmunocomprometidos. Se demostró una jerarquía de condiciones inmunocomprometidas que aumentan el riesgo de una eliminación viral retrasada y la evolución del SARS-CoV-2, en especial en aquellos en los que ambas respuestas de células B y T están suprimidas. De forma específica, se encontró que los individuos con antecedentes de malignidad hematológica y trasplante de órganos demostraron el mayor retraso en la eliminación viral, lo que puede estar mediado por la supresión de ambas respuestas de células B y T. En contraste, aquellos con inmunodeficiencia de células B tuvieron un riesgo intermedio de infección crónica en el contexto de una respuesta inmune, y mostraron una función compensatoria aumentada de células T específicas para el SARS-CoV-2.

Este estudio de cohorte confirmó hallazgos de reportes de casos previos y series de casos. En una revisión de Dioverti et al., los autores resumieron casos de COVID-19 persistente que duraron desde un mes hasta un año. Estos incluyeron una gama de anfitriones inmunocomprometidos, desde individuos con trasplantes de órganos sólidos, malignidades hematológicas y enfermedades autoinmunes que recibían terapias inmunosupresoras. Sin embargo, el inmunocompromiso es un espectro amplio y no quedó claro qué condiciones inmunosupresoras representan el riesgo mayor de infección persistente. Los resultados de este estudio proporcionan una visión crítica sobre la jerarquía del riesgo para la eliminación retrasada de ARN del SARS-CoV-2, la eliminación viral y la evolución viral. De forma específica, se encontró que los individuos con trasplante de órganos sólidos y malignidad hematológica se asocian con el período más largo de eliminación de ARN viral y viral cultivable, seguidos por los participantes más inmunocomprometidos con condiciones autoinmunes que recibían terapia de disminución de células B y aquellos con deficiencia primaria de células B. Los participantes con inmunocompromiso leve no grave, como aquellos con enfermedades autoinmunes que recibían tratamiento con anti-TNF (factor de necrosis tumoral), presentaron una dinámica de eliminación viral similar a la de los participantes no inmunocomprometidos.

Existen varios reportes previos de casos de individuos inmunosuprimidos con COVID-19 crónico y acumulación de polimorfismos virales y mutaciones de resistencia a fármacos, pero hay poca evaluación más sistemática de la evolución viral. En este estudio, se utilizó secuenciación profunda específica para el gen S para evaluar la evolución y diversidad viral a lo largo del tiempo. Los resultados muestran que la inmunosupresión grave se asocia con una mayor evolución y diversificación viral. Además, los anfitriones más inmunocomprometidos tuvieron un mayor riesgo de desarrollar mutaciones emergentes de resistencia al tratamiento con terapia de anticuerpos monoclonales en comparación con los participantes del grupo no inmunocomprometido. Estos hallazgos destacan el potencial de los individuos inmunocomprometidos como fuente de evolución del SARS-CoV-2 y resistencia a fármacos, lo que es consistente con los reportes aislados de anfitriones inmunocomprometidos implicados en la aparición de variantes mutadas del SARS-CoV-2. Cabe señalar, sin embargo, que incluso dentro de la categoría de inmunocompromiso grave, los participantes mostraron una variedad de patrones de diversificación y evolución viral, por lo que se requieren estudios adicionales para evaluar los factores que aceleran la evolución viral.

Otro aspecto destacado del estudio es el análisis detallado de las respuestas de células B y T, que incluye los títulos de anticuerpos neutralizantes y de unión específicos para el SARS-CoV-2, así como los estudios de ELISpot y proliferación de células T. Se observaron títulos más bajos de anticuerpos neutralizantes contra tanto el virus ancestral como contra las variantes en el grupo de inmunocomprometidos graves (menos de 10 a 20 % en comparación con los individuos no inmunocomprometidos), después de ajustar por dosis de vacunación, uso de anticuerpos monoclonales y factores demográficos de confusión. Cada dosis adicional de vacunación se asoció con un aumento de 1.5 veces en los títulos de anticuerpos en toda la cohorte, lo que resalta la importancia de adherirse a las recomendaciones de vacunación contra el COVID-19. Sin embargo, hay evidencia de que la inmunidad no dependiente de células B puede ser suficiente para la eliminación del SARS-CoV-2. Al principio de la pandemia, se reportaron casos de individuos con agammaglobulinemia ligada al cromosoma X que desarrollaron neumonía por COVID-19, pero que de forma subsecuente se recuperaron a pesar de la falta de inmunoglobulinas específicas contra el SARS-CoV-2. En este estudio, el riesgo de infección crónica fue más alto en los participantes HOG-T. Este grupo de participantes mostró respuestas inmunológicas subóptimas tanto humoral como mediada por células. Las frecuencias de respuestas efectoras de ELISpot “casi normales” en individuos HOG-T, en comparación con el grupo no inmunocomprometido, es probable que se deban a la exposición a grandes cantidades de antígeno del SARS-CoV-2, mientras que la reducción en la proliferación demuestra una funcionalidad comprometida. En contraste, los participantes AIG presentaron respuestas proliferativas de células T específicas para el SARS-CoV-2 incluso más robustas que el grupo no inmunocomprometido, lo que indica respuestas funcionales aumentadas de células T CD8+ específicas para el SARS-CoV-2, lo cual se asoció con un riesgo intermedio de infección crónica. Al categorizar a los participantes según el tiempo de eliminación viral, incluso con una respuesta humoral endógena comparable (medida por los títulos de anticuerpos de unión N en este caso), la respuesta de proliferación de células T fue diferente en la etapa temprana de la infección por COVID-19 (dentro de las 2 semanas) entre aquellos que tuvieron una eliminación temprana frente a la retrasada del ARN viral. Estos resultados coinciden con algunos reportes interesantes que indican que los individuos que reciben tratamiento con anti-CD20 pueden mostrar respuestas más fuertes de células T, de forma particular respuestas robustas de células T CD8+ positivas para marcadores de activación (respuesta efectora de células T) y mayor capacidad proliferativa de células T CD8+. Se encontró que tanto la respuesta de células T CD8+ como las respuestas de células T CD4+, incluida la proliferación en respuesta a péptidos específicos de la espiga ancestral y de variantes, fueron más pronunciadas en el grupo AIG en comparación con otros grupos no inmunocomprometidos. Junto con los resultados de otras cohortes, los resultados de este estudio plantean la pregunta de si los individuos con deficiencias de células B podrían tener un riesgo menor de infección persistente por SARS-CoV-2 debido a la preservación de la función de células T, ya sea como un mecanismo compensatorio o por el cebado de células T mediado por ciertas terapias que reducen las células B.

Existen varias limitaciones en este estudio. Se incluyó un número pequeño de individuos con condiciones hematológicas malignas o antecedentes de trasplante, y se pudieron obtener muestras de sangre sólo de un subconjunto de los participantes para caracterizar su inmunidad humoral y de células T. Se necesitan estudios más grandes para proporcionar una mayor precisión sobre la extensión del defecto inmune o el medicamento inmunosupresor que podría poner a los pacientes en mayor riesgo de infección crónica y evolución viral. Los grupos inmunocomprometidos tuvieron una duración mayor de seguimiento que el grupo no inmunocomprometido, pero ambos grupos se siguieron de forma amplia hasta que sus muestras virales fueron negativas para ARN cuantificable del SARS-CoV-2 o hasta que se perdieron en el seguimiento. Los individuos no inmunosuprimidos tuvieron más probabilidades de infectarse con la variante Delta, aunque de forma previa se demostró que no hay diferencias en las tasas de decaimiento viral entre las variantes Delta y Ómicron. Tampoco se analizaron los marcadores que reflejan la inmunidad innata, incluidos los marcadores inflamatorios solubles y los fenotipos de monocitos. Este estudio se centró en las respuestas virológicas e inmunológicas después del COVID-19 y no está claro cómo estas pueden contribuir a la persistencia y gravedad de los síntomas. Además, sólo se evaluaron la inmunidad humoral y celular específica para la proteína espiga, aunque se demostró que la inmunidad dirigida a otras proteínas estructurales o no estructurales altera el curso de la enfermedad. De forma interesante, los autores observaron que, en el contexto de una actividad suprimida de células B, los participantes del grupo AIG tuvieron la mayor proliferación de células T específicas para el SARS-CoV-2 entre todas las categorías de los participantes. Este hallazgo es consistente con reportes recientes de respuestas mejoradas de células T específicas para el SARS-CoV-2 en aquellos que reciben agentes anti-CD20 e incluso vacunación contra el SARS-CoV-2 o infección. Sin embargo, se necesitan más estudios mecanísticos para confirmar que éste es un efecto compensatorio en ausencia de inmunidad humoral.

En conclusión, en esta cohorte prospectiva de individuos bien caracterizados con COVID-19 agudo, se demostró una correlación entre una jerarquía de condiciones de inmunocompromiso y la eliminación viral del SARS-CoV-2, la evolución viral y la inmunidad adaptativa. Estos resultados destacan el hallazgo de que el riesgo de infección crónica por SARS-CoV-2 no es uniforme entre las condiciones inmunosupresoras y proporciona claridad sobre qué condiciones de inmunosupresión predisponen a una eliminación de ARN y cultivo retrasados del SARS-CoV-2, así como a la evolución viral. Las poblaciones de riesgo alto identificadas en este estudio pueden beneficiarse de intervenciones específicas de salud pública y terapias adicionales. Además, los resultados proporcionan más información sobre los correlatos inmunológicos humoral y celular de la eliminación viral, lo cual es crucial para el desarrollo de vacunas mejoradas y futuras terapias.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio

Este estudio es un estudio prospectivo de cohortes que incluyó a participantes consecutivos con diagnóstico reciente de COVID-19 (no se aplicó aleatorización ni enmascaramiento). No se calculó el tamaño de la muestra y se incluyeron a los primeros 1000 participantes seleccionados en esta cohorte. Esto se hizo para garantizar que hubiera suficientes participantes inmunocomprometidos incluidos en el análisis actual. El objetivo general de este estudio prospectivo de cohortes es evaluar de manera longitudinal los aspectos virológicos e inmunológicos del COVID-19 en una población vacunada en su mayoría. Este estudio no proporcionó tratamientos adicionales a los participantes. Los tratamientos antivirales y con anticuerpos monoclonales se proporcionaron por los médicos de los participantes. La carga viral en las muestras nasales, el cultivo viral, las pruebas serológicas y la inmunidad celular se midieron de manera longitudinal.

Se inscribió a los participantes con una prueba positiva de COVID-19 en el Sistema de Salud Mass General Brigham como parte del estudio de características virales posvacunación (POSITIVES), además de un participante inmunocomprometido de un estudio previo. Los registros médicos de cada participante se revisaron para obtener datos demográficos, estado de inmunosupresión e historial de tratamiento para COVID-19 por clínicos certificados por la junta. Para el estudio POSITIVES, los participantes autorrecolectaron hisopos nasales anteriores cada 2 a 3 días para un total de 5 a 6 muestras durante 2 semanas. A todos los participantes en el POSITIVES se les ofreció la oportunidad de recolectar hisopos adicionales cuando fuera posible y se siguieron hasta que tuvieron dos pruebas PCR consecutivas negativas. Para el único participante inmunocomprometido reportado de modo previo, los hisopos nasofaríngeos se recolectaron por proveedores de atención médica. En un subconjunto de participantes que aceptaron proporcionar muestras de sangre, la primera extracción de sangre se realizó antes del día 15 del inicio de los síntomas (fase aguda) o la primera prueba PCR o de antígenos positiva para COVID-19, y la segunda extracción de sangre fue entre los días 15 a 60 después (fase postaguda) (Fig. S6). Este estudio se aprobó por la Junta de Revisión Institucional del Mass General Brigham (número de aprobación: 2021P000812) y todos los participantes firmaron el consentimiento informado al ingresar al estudio.

Categorización de condiciones de inmunocompromiso

Los participantes inmunocomprometidos se categorizaron en los siguientes grupos: participantes inmunocomprometidos de forma grave, los cuales se subdividieron en pacientes con malignidades hematológicas graves/pacientes de trasplante (HOG-T), pacientes con enfermedades autoinmunes graves (AIG, participantes con condiciones autoinmunes que reciben agentes que atacan las células B o deficiencia de células B); y participantes inmunocomprometidos no graves (NG). Esta categorización se basó en un estudio de cohorte reciente que demostró una jerarquía en la respuesta de anticuerpos a las vacunaciones contra el COVID-19 en diferentes condiciones médicas. Los criterios de clasificación detallados se encuentran en la Tabla S1.

Ensayo de carga viral de SARS-CoV-2

El ARN viral de SARS-CoV-2 se cuantificó como se describió de manera previa. De forma breve, los viriones se concentraron a partir del fluido de hisopos nasales mediante centrifugación a 21,000 g durante 2 horas a 4°C. Se añadió Trizol-LS Reagent (Thermo Fisher Scientific) al pellet, se vortexizó e incubó en hielo durante 10 minutos. Se agregó cloroformo y la solución se vortexizó antes de centrifugar a 21,000 g durante 15 minutos a 4°C. El ARN se aisló de la capa acuosa mediante precipitación con isopropanol y se eluyó en agua tratada con DEPC (Thermo Fisher Scientific). Las copias de ARN de SARS-CoV-2 se cuantificaron con un ensayo de carga viral interno con el conjunto de cebadores y sondas CDC 2019-nCoV_N1 (Integrated DNA Technologies). La eficiencia de la extracción de ARN y la amplificación por RT-qPCR (PCR cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa) se evaluó al cuantificar el ARN del virus aviar sarcoma-leucosis con repetición terminal larga (RCAS) recuperado de cada muestra y los dos controles N1. El gen de referencia humano importina-8 (IPO8) también se amplificó y evaluó como una medida de la calidad de la recolección de muestras. Las muestras se procesaron en tres pozos para N1 y en dos pozos para RCAS e IPO8.

Ensayo de cultivo viral de SARS-CoV-2

El cultivo viral se realizó como se informó de forma previa. Se cultivaron células Vero-E6 (American Type Culture Collection, ATCC) en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Corning), suplementado con HEPES (Corning), Penicilina 1X (100 IU/mL)/Estreptomicina (100 μg/ml) (Corning), Glutamina 1X (Glutamax, Thermo Fisher Scientific) y suero fetal bovino a 10 % (FBS; MilliporeSigma) durante 16 a 20 horas antes de la infección. Cada muestra, que consistía en fluido de hisopo nasal, se descongeló en hielo y se filtró a través de un filtro Spin-X de 0,45 μm (Corning) a 10,000 x g durante 5 minutos. Antes de la infección, el medio se cambió a DMEM suplementado con HEPES, Antibiótico/Antimicótico 1X (Thermo Fisher Scientific), Glutamina 1X, 2 % FBS y 5 μg/mL de polibreno (Santa Cruz Biotechnologies). Cada muestra filtrada se utilizó para inocular las células Vero-E6 por spinfection (2,000 x g durante 1 hora a 37°C). Cada condición se sembró en cuadruplicado en una dilución 1:5 a través de la mitad de la placa. Las placas fueron se observaron 7 días después de la infección con un microscopio óptico para verificar efectos citopatogénicos (CPE) y se calculó la dosis infecciosa media en cultivo celular (TCID50) para cada muestra.

Definiciones de la eliminación del ARN viral de SARS-CoV-2 y la eliminación del virus cultivable
La eliminación del ARN viral de SARS-CoV-2 se definió como cuando el ARN viral de SARS-CoV-2 de los hisopos nasales alcanzaba un umbral inferior al cuantificable (<10 copias/ml), y la carga viral de ARN se imputó como 10 copias/ml para fines estadísticos. En los participantes que presentaron rebote viral después de la eliminación inicial del virus, utilizaron el punto de tiempo en el que el ARN viral se volvió no cuantificable, siempre que la carga viral de ARN del rebote estuviera por debajo de 1000 copias/ml. Eligieron este umbral ya que es consistente con las definiciones previas de rebote viral. Para aquellos cuyo rebote superó las 1000 copias/ml, se designó el siguiente punto de tiempo en el que el ARN viral alcanzó un valor inferior a 10 copias/ml como el momento de la eliminación del ARN viral. En cuanto a la eliminación del virus cultivable, se eligió el primer punto de tiempo en el que no hubo efecto de CPE (efecto citopatogénico), y donde todas las muestras posteriores no tenían virus cultivables (si se recolectaron muestras posteriores).

Respuestas de anticuerpos neutralizantes y ensayo de anticuerpos de unión al nucleocápside
La actividad neutralizante contra el seudovirus de SARS-CoV-2 se midió con un ensayo de infección de una sola ronda en células 293T que expresan la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) (células 293T/ACE2). Las partículas del virus seudotipado se produjeron en células 293T/17 (ATCC) mediante cotransfección de plásmidos que codifican la proteína espiga optimizada por codón (ancestral D614G, Delta, Ómicron BA.1, Ómicron BA.2, Ómicron BA.4/5), el plásmido de empaquetado pCMV ΔR8.2, y el plásmido reportero de luciferasa pHR' CMV-Luc. Los plásmidos de empaquetado y luciferasa se proporcionaron por el Dr. Barney Graham (NIH, Vaccine Research Center). La línea celular 293T que sobreexpresa de manera estable el receptor celular ACE2 humano se donó  por los Drs. Michael Farzan y Huihui Ma (The Scripps Research Institute). Para los ensayos de neutralización, se realizaron diluciones en serie de muestras de suero de pacientes en duplicado, seguidas de la adición de seudovirus. Se utilizaron muestras de suero combinadas de pacientes convalecientes de COVID-19 o suero normal saludable prepandemia (NHS) como controles positivos y negativos, de forma respectiva. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C, seguido de la adición de células 293/ACE2 (1x10^4/cada pozo). Los pozos que contenían células + seudovirus (sin muestra) o sólo células actuaron como controles positivos y negativos de infección, de forma respectiva. Los ensayos se cosecharon al día 3 con el reactivo de luciferasa Promega BrightGlo y la luminiscencia se detectó con un luminómetro Promega GloMax (Promega). Los títulos se informaron como la dilución de suero que inhibió 50 % de la infección viral (título ID50). Los ensayos de neutralización basados en seudovirus se realizaron con la proteína espiga ancestral, así como las proteínas espiga Delta y Ómicron (BA.1, BA.2 o BA.4/5). Los títulos de anticuerpos neutralizantes antivariante (nAb) se determinaron en función de la cepa viral con la que cada participante se infectó (ya sea por secuenciación o, en una pequeña proporción, imputada por el momento de infección cuando la cepa específica estaba prevalente). La actividad de los anticuerpos de unión contra la proteína nucleocápside se midió con el Panel ProcartaPlex de 11-Plex Ig Total Humano (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de enzimas ligadas a punto inmunoabsorbente (ELISpot) de células T

El ensayo ELISpot de interferón (IFN)-γ utilizado aquí se reportó en un estudio anterior y se realizó según las instrucciones del fabricante (Mabtech). En resumen, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se incubaron con piscinas de péptidos de SARS-CoV-2 (MGH Peptide Core) a una concentración final de 0.5 μg/ml durante 16 a 18 horas (100,000 a 200,000 células por prueba). Los anticuerpos anti-CD3 (Clone OKT3, BioLegend, 0.5μg/mL) y anti-CD28 (Clone CD28.2, BioLegend, 0.5μg/mL) se utilizaron como controles positivos. Para cuantificar las respuestas específicas al antígeno, se restaron los puntos promedio de los pozos de control negativo con dimetilsulfóxido (DMSO) de los pozos positivos. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de puntos (SFU) por 10^6 PBMCs. Se consideraron positivas las respuestas si los resultados fueron >5 SFU/10^6 PBMCs después de la resta del control. Si los pozos de control negativo DMSO tenían más de 30 SFU/10^6 PBMCs o si los pozos de control positivo (estimulación anti-CD3/anti-CD28) no tenían más de 1000 unidades formadoras de puntos, los resultados se consideraron inválidos y excluidos del análisis posterior.

Ensayo de proliferación de células T

El ensayo de proliferación de células T se reportó de forma previa. De forma breve, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se incubaron en solución salina tamponada con fosfato con 0.5 μM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE; Life Technologies) o CellTrace Far Red (CTFR, Invitrogen) a 37°C durante 20 minutos. Luego, las células se lavaron y resuspendieron a una concentración de 0.5 a 1 × 10^6/mL y se colocaron en placas de 96 pozos en forma de U (Corning) con 200 μL de medio. Se añadieron las piscinas de péptidos a una concentración final de 0.5 μg/mL, seguido de incubación a 37°C y 5 % CO2 durante seis días. Los paneles de anticuerpos para la tinción de PBMCs incluyeron los siguientes: anti-CD3 fitocianina (PE)-cianina (Cy) 7 (clon SK7; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_10640737), anti-CD8 aloficocianina (APC) (clon SK1; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_2075388), anti-CD4 brillante violeta (BV) 711 (clon RPA-T4; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_2564393) y colorante de viabilidad LIVE/DEAD violeta (Life Technologies). Para las PBMCs teñidas con el tinte rojo de proliferación de rastreo lejano de células (CTFR, Invitrogen), las células se lavaron y tiñeron con anti-CD3 APC-Cy7 (clon UCHT1; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_830755), anti-CD8 BV605 (clon SK1; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_2566513), anti-CD4 PE-Cy7 (clon OKT4; BioLegend; dilución 1:100; RRID: AB_571959) y colorante de viabilidad LIVE/DEAD violeta (Life Technologies). Las células se lavaron y fijaron en paraformaldehído al 2 % antes del análisis por citometría de flujo en un BD LSR II (BD Biosciences). Se definió una respuesta positiva de proliferación como un porcentaje de células CD3+CD4+ o CD3+CD8+ CFSEbajo o CTFRbajo con al menos 1.5 veces mayor que el mayor valor de dos pozos de control negativo y superior a 0.2 % de células CFSEbajo o CTFRbajo en magnitud después de la sustracción del fondo.

Secuenciación del gen S de SARS-CoV-2, secuenciación del genoma completo y determinación de variantes

La aislación de ARN viral de SARS-CoV-2 se realizó como se describió de forma previa. El ARN se convirtió en cDNA con la transcriptasa reversa Superscript IV (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La amplificación del gen S se realizó con una estrategia PCR anidada con juegos de cebadores diseñados de forma intermitente que apuntan a los codones 1 a 814 del gen S, como se describió de forma previa. Los productos de PCR de diferentes individuos se agruparon, y la construcción de la biblioteca de Illumina se realizó con el kit de preparación de biblioteca Nextera XT (Illumina). La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina MiSeq y el análisis de datos de secuenciación profunda se llevó a cabo con la plataforma Base de Datos de Stanford sobre Resistencia y Antivirales del Coronavirus (CoVDB) (https://covdb.stanford.edu/sierra/sars2/by-reads/?cutoff=0.01&mixrate=0.01). La alineación de las secuencias FASTQ de entrada con el referente Wuhan-Hu-1 se realizó con MiniMap2 versión 2.22 en el pipeline CodFreq (https://github.com/hivdb/codfreq). La salida de MiniMap2, un archivo SAM alineado, se convirtió en un archivo CodFreq mediante un pipeline disponible de forma pública con una biblioteca PySam (versión: 0.18.0) y se analizó de forma posterior con CoVDB. Las ejecuciones de PCR y la secuenciación se realizaron una vez con los controles positivos y negativos apropiados. Para el análisis del gen S, las variantes de aminoácidos se llamaron a nivel de codón con código Perl y se usaron para la interpretación de la resistencia con un límite de detección de 1 %. La precisión de las plataformas de secuenciación profunda se evaluó con una biblioteca control de secuencias clonales de SARS-CoV-2 mezcladas en concentraciones conocidas, como se describió de forma previa. Las mutaciones detectadas por secuenciación de nueva generación en menos de 20 % de la población viral se etiquetó como variantes de “frecuencia baja”, ya que se pasarían por alto por la secuenciación tradicional Sanger. Se requirió una cobertura mínima promedio de secuenciación de 500x por muestra para llamar variantes. La llamada de variantes de SARS-CoV-2 se realizó con tres plataformas de llamada de variantes diferentes, a saber, CoVDB, Scorpio call v1.2.123 (https://pangolin.cog-uk.io/) y Nextclade v.1.13.2 (https://clades.nextstrain.org/). Los datos de secuenciación de nueva generación utilizados para el análisis de datos en este manuscrito están disponibles en el Archivo de Lectura de Secuencias (SRA) del NCBI con el número de acceso PRJNA1027562. La secuenciación del genoma completo de SARS-CoV-2 se realizó según el protocolo descrito en las publicaciones anteriores de los autores. La información sobre variantes se obtuvo mediante secuenciación del gen S (descrito de forma previa), WGS o por información epidemiológica (período de tiempo en el que el participante se infectó si la secuenciación del gen S o la información de WGS no estaban disponibles).

Análisis de variación de un solo nucleótido, diversidad genética y análisis de mutaciones de resistencia a mAb

Para evaluar la variación de un solo nucleótido intrahospedador (VUSNi), sólo se incluyeron los datos de los participantes para los que se disponía de datos de secuenciación de línea basal y al menos un punto de seguimiento. El análisis de VUSNi se realizó con la cartera PASeq SARS-CoV-2 (www.paseq.org). De forma breve, los archivos de secuenciación crudos se filtraron por calidad y se recortaron los adaptadores con trimmomatic (v0.30). Las secuencias contaminantes se filtraron con BBMap Suite (v35.76). Las lecturas duplicadas se detectaron con fastuniq (v1.1). Las lecturas no redundantes de alta calidad se alinearon con el referente de SARS-CoV-2 Wuhan (NC_045512.2) con Bowtie2 (v.2.3.2). Las alineaciones resultantes se procesaron con samtools (v.1.2) e iVar (v1.4.2) para obtener archivos VCF de variantes nucleotídicas. Se excluyeron del análisis de VUSNi las variantes nucleotídicas presentes a 100 % de frecuencia de la población viral total en todos los puntos de tiempo, indicativas de mutaciones definitorias de linaje. La diversidad genética entre múltiples secuencias de un individuo se evaluó mediante la distancia promedio entre las secuencias en MEGA tanto a nivel nucleotídico como de aminoácidos con la secuencia consensuada del gen S. Las mutaciones de escape de los anticuerpos monoclonales (mAb) se definieron según la hoja informativa de autorización para uso de emergencia (EUA) para cada mAb, como se lista en la Tabla S5.

Ecuación de estimación generalizada (GEE)

Se realizó una GEE con el paquete “geepack” (versión 1.3.9) en R . En el modelo GEE, la familia se estableció como “gaussiana”, y la estructura de correlación (“corstr”) se configuró como “independencia”. El Criterio de Información Cuasi (QIC) se utilizó para comparar modelos con “independencia”, “intercambiable” y “ar1”, y el modelo con “independencia” fue el que tuvo el menor QIC. El uso de mAb, las semanas desde el inicio de los síntomas o la primera prueba PCR o de antígeno positiva, el número de vacunaciones antes de la inscripción, el sexo y la edad se ajustaron en estos modelos. El logaritmo en base 10 de los títulos de anticuerpos neutralizantes se trató como variable dependiente y las otras variables como independientes. Los coeficientes de todas las variables independientes se trasformaron a la potencia de 10 y se mostraron en esta figura como el cambio de pliegue en comparación con el grupo de referencia.

Emparejamiento por puntuación de propensión para la eliminación retardada frente a la temprana de ARN viral

Definieron la eliminación retardada de ARN viral como la eliminación de ARN viral de SARS-CoV-2 más allá del día 30 o ARN viral positivo más allá del día 10 y luego perdido en el seguimiento. Para comparar las respuestas de las células T al controlar por inmunidad humoral, se emparejaron a los participantes con eliminación viral retardada (n = 5) en una proporción 1:3 con aquellos con eliminación temprana. Dado que los títulos de anticuerpos específicos de nucleocápside no se afectaron por el uso de mAb, se decidió utilizar los anticuerpos específicos de nucleocápside como un marcador de las respuestas humoral endógenas. Cabe destacar que el participante ID 245 sólo tenía anticuerpos específicos a nucleocápside en la extracción de sangre 2 y el valor estaba por debajo o igual al rango de cuantificación de 0.11 IU/ml; por lo tanto, se imputaron los títulos de anticuerpos de unión en la extracción de sangre 1 con los mismos títulos de anticuerpos de unión de la extracción de sangre 2, sólo para fines de emparejamiento por propensión. Se utilizó el paquete “MatchIt” (versión 4.5.5) para realizar el emparejamiento por propensión, con los parámetros predeterminados, excepto con el método “óptimo”.

Análisis estadístico

Todos los datos crudos a nivel individual para experimentos donde n < 20 se presentan en el archivo de datos S1. Las variables categóricas se resumieron con el número total y el porcentaje, y se utilizó la prueba chi cuadrada o la prueba exacta de Fisher cuando no se cumplía la regla de bondad de ajuste de chi cuadrada para determinar la significancia. Las variables continuas se resumieron con la mediana y los rangos intercuartílicos y se compararon con métodos no paramétricos para determinar la significancia: se utilizó la prueba de rango-suma de Wilcoxon para comparar dos grupos y la prueba de Dunn con ajuste de Benjamini-Hochberg para comparar tres o más grupos. Las comparaciones dentro de los grupos se realizaron con la prueba de rango con signo emparejado de Wilcoxon sin ajuste para comparaciones múltiples para determinar la significancia. También se utilizó la ecuación de estimación generalizada (GEE) con estimación gaussiana para evaluar las diferencias entre grupos al tener en cuenta la medición repetida durante el seguimiento longitudinal. No se utilizaron métodos paramétricos para evaluar las variables continuas, por lo que se permitieron datos con distribución no normal. La suposición de riesgos proporcionales no se cumplió para los modelos de regresión de Cox, por lo que también se utilizó el modelo de tiempo de supervivencia medio restringido (TRPS) para validar los hallazgos (paquete survRM2 en R versión 1.0.4). Se utilizaron pruebas bilaterales para todos los análisis y P < 0.05 se consideró significativa, a menos que se indique lo contrario. Los datos presentados en este estudio representaron réplicas biológicas. Se utilizó R (4.3.0) para los análisis estadísticos.

Yijia Li et al. , SARS-CoV-2 viral clearance and evolution varies by type and severity of immunodeficiency. Sci. Transl. Med.16,eadk1599(2024).DOI:10.1126/scitranslmed.adk1599

Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México

Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor

Dra. Med. Rosa Ivett Guzmán Avilán Profesor

Dra. Silvia Rosario Avilés Vargas Residente 1er Año

Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor