El asma es una enfermedad heterogénea de las vías respiratorias que se presenta con diferentes tipos y grados de inflamación, a menudo en asociación con cambios estructurales en las paredes de las vías respiratorias. Los granulocitos inflamatorios infiltrantes, como los eosinófilos y/o los neutrófilos, y las células estructurales residentes de las vías respiratorias participan en los procesos inflamatorios y de remodelación del asma por medio de distintos mecanismos.
La inflamación tipo 2 (T2) se caracteriza por el aumento de la expresión de citocinas asociadas a T2, como IL-4, IL-5 e IL-13 en la mucosa bronquial. El asma eosinofílica grave por lo general se asocia con enfermedad de inicio tardío y estos pacientes presentan exacerbaciones frecuentes, pólipos nasales, obstrucción fija del flujo de aire y dependencia de la terapia con corticoesteroides orales, y responden a terapias biológicas dirigidas a T2 como tratamientos con anticuerpos anti-IL5, anti-IL5Rα o anti-IL4Rα. Los recuentos de eosinófilos en el esputo pueden reflejar de manera más confiable la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias que un recuento de eosinófilos en sangre. Sin embargo, la inducción del esputo es invasiva y no siempre tiene éxito en la producción de muestras adecuadas en pacientes con asma. Los recuentos de eosinófilos en sangre se utilizan como un indicador indirecto de la eosinofilia en esputo, con una correlación moderada a buena entre los recuentos de eosinófilos en sangre y los recuentos de eosinófilos en esputo.
Los recuentos elevados de eosinófilos en sangre en sujetos con asma se asocian con una mayor hiperreactividad bronquial, una función pulmonar deficiente y niveles más altos de IgE sérica. Además, los pacientes con asma y recuentos elevados de eosinófilos en sangre presentaron más pólipos nasales, un mayor deterioro en la función pulmonar, niveles más altos de IgE sérica y de fracción exhalada de óxido nítrico (FeNO), todos biomarcadores de la inflamación tipo 2. En la práctica clínica, los niveles séricos de IgE se utilizan para identificar el fenotipo de asma alérgica, mientras que los recuentos actuales o históricos de eosinófilos en sangre por encima de 150-300/μL y los niveles de FeNO de ≥25 ppb se utilizan para indicar el asma eosinofílica o tipo 2.El asma neutrofílica, que se considera como un asma no tipo 2 (T2) o T2 bajo, se definió por un recuento alto de neutrófilos en muestras de esputo sin un recuento alto de eosinófilos y se relacionó con la presencia de células tipo 1 y Th17 activadas, junto con una sobreexpresión de IFN-γ, TNFα, IL-1β e IL-17. Por clínica, el asma neutrofílica se caracteriza por exacerbaciones menos frecuentes que el asma eosinofílica y un grado moderado de obstrucción del flujo de aire. Un estudio de asma neutrofílica la cual se definió por un recuento alto de neutrófilos en sangre con recuentos bajos de eosinófilos en sangre encontró que se asociaba con niveles altos de proteína C reactiva, metaloproteinasa de matriz-9, IL-6, leptina y niveles séricos de receptor soluble del activador de plasminógeno urocinasa. Este fenotipo neutrofílico no T2 o T2 bajo no tiene terapias biológicas dirigidas, ya que las vías clave que lo impulsan no están claras. Existe una necesidad de una definición más detallada de los fenotipos del asma al utilizar biomarcadores sanguíneos no sólo para informar sobre las vías moleculares subyacentes, sino también para facilitar elecciones terapéuticas personalizadas. Por lo tanto, la hipótesis es que el análisis proteómico a gran escala de proteínas séricas en pacientes bien caracterizados identificará marcadores que pueden ser útiles para determinar subtipos de asma.
En el presente estudio, se utilizaron perfiles proteómicos de alta resolución en 686 participantes con asma de leve a moderada y grave de dos cohortes para identificar un conjunto de proteínas séricas que serían predictivas del estado de asma eosinofílica o neutrofílica según los umbrales clínicos establecidos de recuentos de granulocitos en sangre y esputo, e investigar las vías moleculares subyacentes. Se compararon los biomarcadores séricos identificados y su capacidad predictiva con la de los biomarcadores en esputo obtenidos en un subconjunto que proporcionó tanto muestras de sangre como de esputo.
Métodos
Población de estudio y recopilación de datos
Se combinaron pacientes con asma leve-moderada y grave de las cohortes Biomarcadores Imparciales para la Predicción de los Resultados de Enfermedades Respiratorias (U-BIOPRED) y Endotipos de Enfermedades de las Vías Respiratorias para Terapias Personalizadas (ADEPT) para aumentar el contraste entre el asma grave y no grave y tener un espectro más amplio para el asma grave, ya que la cohorte de U-BIOPRED se compone de manera principal por pacientes con asma grave, mientras que ADEPT es de manera principal de leve a moderada. U-BIOPRED es un estudio multicéntrico europeo transversal de participantes asmáticos de 12 países europeos y ADEPT es un estudio europeo y norteamericano con participantes asmáticos.
En ambas cohortes, se recogieron muestras de suero (n = 574) y de esputo (n = 182) de los participantes junto con datos demográficos, clínicos y fisiológicos. Para los participantes (n = 62) de ADEPT, se recolectó una muestra de suero adicional dos semanas después del reclutamiento. Las muestras de esputo se obtuvieron por inhalación de solución salina hipertónica y de manera posterior se analizaron tapones de esputo, con recuentos de eosinófilos y neutrófilos medidos como marcadores de inflamación. Los sobrenadantes de esputo se almacenaron para su ensayo proteómico posterior. También se almacenaron muestras de suero al mismo tiempo y se obtuvieron recuentos de neutrófilos y eosinófilos en sangre mediante pruebas hospitalarias de rutina. Los datos demográficos y clínicos faltantes (tasas de ausencia en la Tabla Suplementaria S1) se imputaron al utilizar k vecinos más cercanos (el número de vecinos más cercanos es 5), se usó el paquete r, VIM o número imputado.
Se midieron un total de 1129 proteínas de forma original en los sobrenadantes de esputo y muestras de suero al utilizar el ensayo proteómico SOMAscan. Después de excluir proteínas que no se encontraban dentro del rango de validez proporcionado por Somalogic, se dispuso de 1129 proteínas en suero y 1125 proteínas en esputo en las muestras de U-BIOPRED, y 1129 proteínas en suero y 1128 proteínas en esputo en las muestras de ADEPT. Al considerar sólo las proteínas que se midieron en ambos estudios y en ambos medios, los datos finales incluyeron 1124 proteínas medidas en 574 pacientes con perfil proteómico sérico y 182 pacientes con perfil proteómico de esputo, algunos pacientes tuvieron perfiles de esputo y suero (n = 178, 70 de U-BIOPRED y 108 de ADEPT).
Los datos se normalizaron en primer lugar para eliminar la variación de hibridación dentro de una ejecución, después se realizó la normalización por mediana para eliminar otros sesgos del ensayo. Los datos se estandarizaron mediante la puntuación z y de forma posterior se transformaron mediante logaritmo y centraron.
El estado eosinofílico en sangre (alto vs bajo) de los participantes se determinó al usar un punto de corte de recuento de eosinófilos en sangre de ≥300/μL. Debido a la falta de una definición acordada de asma neutrofílica basada en el recuento de neutrófilos en sangre, se utilizó un punto de corte de ≥7500/μL, al ser el límite superior del rango normal del recuento de neutrófilos en sangre.
El estado de eosinófilos y neutrófilos en el esputo se definió al utilizar la proporción de cada tipo de célula entre los granulocitos: se definió un estado de eosinofilia y neutrofilia en el esputo alto como ≥1.5 % y ≥73.6 % del recuento granulocítico del esputo, de manera respectiva.
Debido a que se utilizaron puntos de corte alternativos con respecto a la definición de asma eosinofílica y neutrofílica y para interrogar la validez y/o especificidad de los hallazgos, se consideraron puntos de corte alternativos para el estado eosinofílico y neutrofílico en las muestras de suero y esputo: ≥3 % y ≥150/μL para el estado eosinofílico en el esputo y en sangre, de manera respectiva, y ≥60 % y 5000/μL para el estado neutrofílico en el esputo y en sangre, de manera respectiva.
Ética
Se obtuvo la aprobación ética en todos los centros participantes para ambos estudios y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT01982162 y NCT01274507). La inclusión, los comités éticos y la estratificación inicial se detallan en otro lugar.
Análisis estadístico
Selección de variables
Se utilizó regresión logística penalizada con la técnica de mínimos cuadrados con encogimiento absoluto y selección de variables (LASSO) en un marco de selección de estabilidad para identificar un conjunto reducido de proteínas que explicaran el estado eosinofílico o neutrofílico (binario) por separado, tanto en perfiles proteómicos de suero como de esputo. Para cada resultado (estado eosinofílico o neutrofílico) y cada muestra biológica (suero o esputo) por separado, el modelo de regresión penalizado se ejecutó durante 1000 iteraciones en submuestras de 50 % de la población de estudio. Para un valor dado de la penalización, se calculó la proporción de selección por proteína como el número de veces que se seleccionó en el modelo una proteína específica por medio de las 1000 submuestras. La calibración de la penalización (control de la dispersión del modelo LASSO) y de la proporción de selección por encima de la cual se considera que una característica se selecciona de forma estable (control de la estabilidad del modelo, condicionada al parámetro de escasez) se lleva a cabo al maximizar una puntuación que mide una probabilidad logarítmica negativa bajo la hipótesis de equiprobabilidad de selección (es decir, inestabilidad). Estos análisis se llevaron a cabo al usar el paquete R “nítido”.
Los modelos de selección de variables se ajustaron sólo por edad y sexo y de manera posterior (sin penalizar las variables correspondientes) por variables clínicas establecidas, se incluyó índice de masa corporal (IMC), edad de inicio del asma, puntuación del cuestionario de control del asma (ACQ), volumen espiratorio forzado en el primer segundo (FEV1) predicho, presencia o ausencia de pólipos nasales, dosis de corticoesteroides orales, historial de tabaquismo en paquetes-año, número de exacerbaciones por año y relación FEV1/capacidad vital forzada (FVC), como se detalla en la Tabla 1. Para evaluar la reproducibilidad del modelo principal de selección de variables (selección de estabilidad con LASSO logístico), se volvió a ejecutar la selección de estabilidad LASSO en 100 submuestras independientes compuestas por 80 % de los datos. Se reportó la proporción de selección por proteína resultante obtenida por medio de las (N = 100) submuestras.
Evaluación del rendimiento del modelo
Se cuantificaron las capacidades predictivas de las proteínas seleccionadas mediante la ejecución de series de modelos de regresión logística no penalizados. Los coeficientes del modelo se estimaron por medio de 1000 iteraciones del procedimiento de división de entrenamiento y prueba, donde los conjuntos de datos se dividieron de manera aleatoria en subconjuntos de entrenamiento 80 % y 20 % de prueba en todo el conjunto de datos. Cada modelo se reajustó en el conjunto de entrenamiento y luego se probó 20 % de observaciones no vistas para informar el área bajo la curva (AUC) con intervalos de confianza (IC) 95 %. Para una evaluación adicional, el modelo recalibrado se probó en las mediciones repetidas de participantes del estudio ADEPT. Ya que no se siguió a pacientes con recuento alto de neutrófilos en la cohorte ADEPT, esa validación adicional se limitó al estado eosinofílico en suero.
Para evaluar la cantidad de información que los niveles de proteínas aportan por encima de los factores clínicos establecidos enumerados, se ejecutó una serie de modelos logísticos que incluyen estos factores y se agregaron de forma secuencial proteínas seleccionadas de manera estable (del modelo ajustado para factores clínicos) en orden decreciente de proporciones de selección y se reportó el AUC correspondiente (e IC 95 %) en el conjunto de prueba.
Papel de los financiadores
Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño y la realización del estudio; la recolección, gestión, análisis e interpretación de los datos; y la preparación, revisión o aprobación de este manuscrito.
Resultados
Resumen de la población del estudio
En la Tabla 1 se presentan estadísticas resumidas de las características demográficas y clínicas clave de los participantes para la población total del estudio y las dos cohortes que contribuyeron por separado. El estudio incluyó más mujeres que hombres (56.6 %) y la edad promedio de inicio fue 24.5 años. Ambas características presentaron similitudes en ambos estudios. Por diseño, el estudio ADEPT incluyó casos de asma más leves en comparación con los participantes de U-BIOPRED, lo que resultó en que los participantes de U-BIOPRED mostraran (i) una función pulmonar reducida, (ii) un IMC más alto, (iii) una mayor exposición al tabaquismo, (iv) niveles más altos de eosinófilos en esputo y neutrófilos en suero, (v) niveles más bajos de neutrófilos en esputo y (vi) un mayor uso de corticoesteroides orales (OCS).
Proteínas séricas y de esputo asociadas con el estado eosinofílico
Un total de 13 proteínas séricas se seleccionaron de manera estable (con una proporción de selección mayor al umbral calibrado en 66 %) en los análisis de selección de estabilidad LASSO de estado eosinofílico sérico (Fig. 1a). Estas incluyeron la Proteína Plasmática A asociada al Embarazo (PAPP-A) y la quimiocina regulada y activada del timo y (TARC, ahora conocida como ligando de quimiocina CC 17 [CCL17]), con proporciones de selección de 1 y 0.98, de manera respectiva. Al ejecutar la selección de estabilidad LASSO en 100 particiones diferentes de la población de estudio, se encontró que PAPP-A y TARC/CCL17 son las dos proteínas seleccionadas más consistentes (Figura Suplementaria S1). La inclusión de las 13 proteínas estables en el modelo de regresión logística para predecir el estado sérico dio un AUC de 0.83 (IC 95 %: 0.82-0.84) (Fig. 1b).
Los modelos de selección de estabilidad ajustados para factores clínicos definidos seleccionaron 13 proteínas, como PAPP-A y TARC/CCL17, junto con otras ocho proteínas que también se seleccionaron en el modelo no ajustado (Fig. 2a), además de tres proteínas: cinasa Janus 2 (JAK2), receptor soluble de interleucina 4 (IL-4sR), y aminopeptidasa 1 del retículo endoplásmico (ARTS1) lo que resultó en un AUC de 0.84 (IC 95 %: 0.83-0.84). Los modelos que incluyen variables clínicas y agregan proteínas de forma secuencial en orden descendente de proporción de selección (Fig. 3a) mostraron que el modelo que incluía sólo PAPP-A produjo un AUC de 0.75 (IC 95 %: 0.75-0.76) y que la adición de TARC/CCL17 produjo un AUC de 0.78 (IC 95 %: 0.77-0.78). Esto fue superior al del modelo que sólo incluía marcadores clínicos establecidos [AUC = 0.62 (IC 95 %: 0.61–0.63)].
El modelo proteómico para el estado sérico eosinofílico se ajustó a los datos recopilados de la cohorte ADEPT catorce días después de la inscripción (Tabla suplementaria S2) y arrojó un AUC de 0.76 (IC 95 % 0.63-0.89), lo que respalda la generalizabilidad de los resultados.
En el momento en que se predijo el estado de eosinófilos en el esputo al utilizar datos proteómicos de esputo, sólo PAPP-A se seleccionó de manera estable (Fig. 1a), lo que produjo un AUC de 0.81 (IC 95 % 0.80-0.81) (Fig. 1b). PAPP-A también se seleccionó en el modelo que ajustaba para variables clínicas establecidas (Fig. 2b), lo que sugiere que proporcionaba información relevante sobre el estado eosinofílico que no se capturó por las variables clínicas: el AUC del modelo ajustado que incluía PAPP-A fue 0.79 (IC 95 % 0.76-0.82), en comparación con 0.63 (IC 95 % 0.58-0.67) para el modelo que sólo incluía factores clínicos establecidos (Figura suplementaria S2).
Proteínas séricas y de esputo asociadas con el estado neutrofílico
La estabilidad de la regresión logística LASSO (Fig. 1c) para el estado neutrofílico resultó en 12 proteínas séricas estables (con proporción de selección por encima del umbral calibrado de 0.64) con un AUC que corresponde a 0.91 (IC 95 % 0.90-0.92) (Fig. 1d). Las proteínas con las proporciones de selección más altas son la metaloproteinasa de matriz (MMP-9) (proporción de selección: 0.85) y el receptor de ectodisplasina A (EDAR) (proporción de selección: 0.80). Al ejecutar los modelos de estabilidad LASSO (Figura suplementaria S3) en 100 subconjuntos diferentes de la población de estudio, se encontró que MMP-9 y el quimioatrayente de linfocitos B (BLC) son las proteínas seleccionadas con más frecuencia.
Mientras se ajustaba para variables clínicas, se seleccionaron de manera estable 5 proteínas (MMP 9, EDAR, grupo IIE de la fosfolipasa A2 [PLA2G2E], receptor tipo 4 de interleucina 1 [IL-1-R4] ahora conocido como IL1RL1/IL33R y Elafina), todas las cuales se seleccionaron en el modelo no ajustado (Fig. 2c). Estas proteínas adicionales aumentaron el AUC de 0.72 (IC: 0.70-0.74) (para el modelo que incluía solo covariables clínicas) a 0.89 (IC: 0.88-0.90) con la adición de proteínas (Fig. 3b). Sin tener en cuenta el ajuste para factores clínicos establecidos, ninguna proteína de esputo se asoció con el estado neutrofílico al usar el análisis de estabilidad logística LASSO (Fig. 1c y 2d).
Uso de puntos de corte alternativos para definir el asma eosinofílica y neutrofílica
Al cambiar el punto de corte en suero para la clasificación de eosinofilia de 300/μL a un umbral inferior de 150/μL, PAPP-A e IgE se seleccionaron de manera constante (Figura suplementaria S4). IL5Rα y TARC/CCL17, que son prominentes en el análisis original, ya no se seleccionaron con esta definición alternativa.
El punto de corte para clasificar a los sujetos con nivel alto de eosinófilos al usar datos de esputo en el análisis original fue ≥1.5 %, mientras que otros estudios usaron 3 %. Al usar esa definición alternativa de estado eosinofílico alto (Figura suplementaria S5), el modelo logístico LASSO seleccionó a PAPP-A y a la catepsina G (que no se seleccionó en el análisis original) como asociadas con el estado eosinofílico.
Aunque el asma neutrofílica no tiene una definición acordada, se utilizó un umbral alternativo de 5000/μL. MMP-9, catepsina S y GIIE/PLA2G2E (Figura suplementaria S6) se superpusieron con las encontradas en la definición original. Por último, cambiar el punto de corte para la clasificación de neutrófilos en esputo de 73.6 % a 60 % llevó a la selección estable de 3 proteínas de esputo, a saber, la anhidrasa carbónica I, CD23 y CD27 (Figura suplementaria S7).
Discusión
Se utilizaron los conjuntos de datos de asma U-BIOPRED y ADEPT para proporcionar biomarcadores proteómicos séricos y de esputo vinculados tanto a los niveles de eosinófilos como de neutrófilos en sangre y esputo, de modo particular en pacientes con asma grave, ya que estos representan marcadores de inflamación T2 y no T2, de manera respectiva. Los modelos utilizados demostraron ser exitosos, con áreas bajo la curva (AUC) que oscilaron entre 0.80 y 0.91, lo que muestra la capacidad de separación de clases de los datos proteómicos séricos y de esputo. Las proteínas seleccionadas de forma estable que se identificaron añaden la información adicional y la premisa de que las covariables clínicas por sí solas no pueden explicar y, por lo tanto, podrían proporcionar información más granular sobre las vías biológicas que subyacen a estos fenotipos del asma.
Se identifico un conjunto de proteínas que se asociaron con eosinofilia en sangre y esputo, y de éstas, sólo PAPP-A se identificó tanto en sangre como en esputo al usar el umbral de ≥300/μL y ≥1.5 %, de manera respectiva. Se encontró que PAPP-A contribuía con información adicional más allá de la edad, el sexo y los factores clínicos establecidos, y se encontró que su asociación era robusta. Además, doce proteínas séricas adicionales se asociaron con el estado eosinofílico en sangre, muchas de las cuales se relacionaron de forma previa con la inflamación tipo 2, como se discute a continuación.
El rendimiento predictivo para el estado eosinofílico fue mejor de forma leve para los modelos que utilizaban datos proteómicos séricos en comparación con los modelos basados en datos de esputo, aunque esto podría deberse al tamaño más grande de muestra de suero en comparación con el de esputo. Para verificar esto, se volvió a realizar el análisis en una submuestra (n = 182) de los datos de suero, donde las características clave de los participantes en esa submuestra se controlaron para que fueran iguales que en la población completa. Las áreas bajo la curva (AUC) para la eosinofilia en suero se redujeron a 0.73 (IC 95 %: 0.72-0.74) y no se seleccionó ninguna proteína para el asma neutrofílica. Esto podría sugerir que parte de la menor potencia/poder predictivo de los datos de esputo se relacionó con el tamaño de muestra más pequeño.
Muchas, pero no todas, de estas proteínas séricas se asocian con la inflamación eosinofílica tipo 2. La PAPP-A sérica, una proteasa de la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 4 (IGFBP-4), se reportó de manera previa como la más alta en el suero de pacientes con asma en comparación con pacientes sin asma, y en pacientes con asma alérgica grave tratados con el anticuerpo monoclonal anti-IgE omalizumab, los niveles séricos de PAPP-A se redujeron. Con el reajuste del umbral de recuento eosinofílico a un recuento de eosinófilos en sangre de ≥150/μL y en esputo de ≥3 %, se seleccionaron PAPP-A e IgE, y PAPP-A y catepsina G en sangre y esputo, de manera respectiva. Esto refuerza el valor de PAPP-A tanto en suero como en esputo y su asociación con la inflamación tipo 2, aunque su papel funcional y lugar de acción aún deben confirmarse en las vías respiratorias.
Los biomarcadores IgE e IL5Rα que se seleccionaron son el objetivo de dos terapias biológicas diferentes, a saber, omalizumab que se dirige a IgE, y el anticuerpo monoclonal, benralizumab, que se dirige a IL5Rα. Los niveles séricos de IgE se utilizaron para determinar la cantidad de omalizumab que se debe administrar a pacientes con asma alérgica grave para lograr una respuesta óptima, mientras que los recuentos de eosinófilos en sangre se utilizaron como biomarcador para seleccionar a aquellos con mayor probabilidad de responder a benralizumab. El cistatina SN (CYTN), codificado por CST1, es un inhibidor de la cisteína proteinasa que se encuentra en mayores concentraciones en sobrenadantes de esputo y suero en asmáticos con un control débil en comparación con asmáticos bien controlados, y también aumenta su expresión en la rinitis alérgica. El cistatina SN previene la disrupción de la barrera epitelial de las vías respiratorias por proteasas alergénicas. Los niveles de TARC/CCL17 e IgE se incrementan en pacientes mayores con asma (y asma alérgica). TARC/CCL17 es un quimioatrayente de las células Th2, lo que explica su asociación con el asma eosinofílica, pero no la relación con el envejecimiento, lo cual requiere más investigación. La supresión de TARC/CCL17 podría reducir de forma potencial la hiperreactividad de las vías respiratorias y la eosinofilia, mientras que otro estudio se encontró que los niveles de TARC/CCL17 se correlacionaban de manera negativa con el VEF1%. El dupilumab demostró reducir el TARC sérico, junto con una reducción en la eotaxina-3 plasmática y la periostina sérica, así como en la IgE sérica en el asma eosinofílica grave, lo que respalda a TARC/CCL17 como un posible biomarcador del asma eosinofílica y de aquellos que responden a dupilumab.
CCL28 se expresa por las células epiteliales mucosas y atrae a muchas células inmunes, células T y eosinófilos. Se relaciona la infección respiratoria viral grave con el reclutamiento de células Th2 productoras de IL-13 mediante la inducción del receptor de IgE de alta afinidad para células dendríticas (FcεRI) y CCL28. CCL28 también puede tener un papel en la patogénesis del asma, con niveles altos de CCL28 en esputo y receptores de CCL28 expresados en eosinófilos en pacientes con asma y enfermedad atópica. Para el asma neutrofílica, se identificaron 12 proteínas séricas con un recuento de neutrófilos en sangre de ≥7500/μL, y de estas, cinco (MMP-9, EDAR, GIIE/PLA2G2E, IL-1-R4/IL1RL1 y elafina) añadieron poder predictivo a los factores clínicos establecidos. De las 12 proteínas séricas, 5 se relacionaron con proteasas/anti-proteasas: MMP-9, elafina, BLC (CXCL13) y catepsina S, 3 con otras enzimas: BMX (no receptores de cinasa de tirosina), TGM3 (transglutaminasa 3) y GIIE/PLA2G2E (fosfolipasa A2 secretada), mientras que otras se relacionaron con IL-1R4/IL1RL1 (el receptor de IL33) y EDAR (receptor de ectodisplasia A). De éstas, MMP-9 y catepsina S pueden asociarse de forma directa con los neutrófilos. MMP-9, que se produce de manera principal por macrófagos y neutrófilos, se involucra en la remodelación de las vías respiratorias y los pulmones, con niveles altos reportados en sangre, esputo y líquido de lavado broncoalveolar de pacientes con asma. Catepsina S, que es una proteasa cisteína lisosomal, desempeña un papel importante en la regulación de la hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por oxidantes y en el reclutamiento de neutrófilos en ratones, y se mostraron niveles altos en la inflamación alérgica pulmonar con un posible papel en la remodelación pulmonar. BCL (CXCL13) es un fuerte factor quimioatrayente para células B que interactúa con el receptor CXCR5 el cual se expresa en las células B. Los niveles de CXCL13 en el esputo de los niños asmáticos son más altos de forma significativa que los del grupo de control, y los niveles de CXCL13 en plasma o suero de adultos con asma aumentaron en pacientes con antecedentes de exacerbaciones o durante las exacerbaciones. La fosfolipasa A2 secretada (sPLA2), activada durante la activación mediada por IgE de las células cebadas que conduce a la generación de eicosanoides, demostró tener una actividad aumentada en el líquido de lavado broncoalveolar de pacientes con asma, en especial después del desafío alergénico. La sPLA2 puede promover el reclutamiento de neutrófilos. De manera singular, la activación del receptor de IL-33 en las células cebadas por la alarmina IL-33 puede conducir a una inflamación neutrofílica. En el momento en que el umbral de recuento de neutrófilos en sangre se redujo a ≥5000/μL, la MMP-9, la catepsina S y la sPLA2 permanecieron asociadas con el estado neutrofílico.
No se encontraron proteínas en el esputo asociadas con el estado de los neutrófilos al utilizar un recuento de neutrófilos ≥73.6 %. Con un umbral de recuento de neutrófilos más bajo ≥60 %, se eligieron tres proteínas: la anhidrasa carbónica 1, CD23 y CD27. El papel de estas proteínas en el contexto del asma neutrofílica sigue sin estar claro, aunque CD23 es el receptor de baja afinidad de la IgE, y CD27 es un miembro de la superfamilia de receptores del TNF y su interacción con CD70 se involucra en la diferenciación de células B en células plasmáticas.
Existen algunas limitaciones en este estudio. La combinación de los conjuntos de datos de U-BIOPRED y ADEPT podría introducir cierto sesgo, en especial en el análisis de los fenotipos sanguíneos, donde 80 % de los participantes provenían de U-BIOPRED. El análisis de los fenotipos del esputo se basó en una contribución más equilibrada de ambos estudios. Sin embargo, se pudieron replicar los resultados en las mediciones longitudinales en ADEPT.
Además, el hallazgo de menos proteínas explicativas en los datos de esputo se puede relacionar con un poder estadístico menor para estos análisis que dependen de un número menor de muestras disponibles. De acuerdo con esto, mientras los datos séricos se submuestrearon para que coincidieran con el tamaño de la muestra de los análisis de esputo, se seleccionaron menos variables y el AUC fue menor. Sin embargo, la diferencia en el tamaño de la muestra entre el esputo y el suero representa lo que está disponible en el mundo real, ya que la sangre es más fácil de recolectar que el esputo. Otra limitación de este estudio es la suposición de que un paciente tiene o bien un estado alto de eosinófilos o de neutrófilos, por lo tanto, se pasó por alto a participantes con eosinófilos y neutrófilos altos (“estatus mixto”). El trabajo futuro debería investigar los estados de asma de manera conjunta. El análisis de sensibilidad utilizó valores de corte alternativos (más bajos) para los recuentos de células sanguíneas, lo que a su vez pudo diluir el efecto de algunas proteínas. Ese efecto de dilución podría, al menos de manera parcial, explicar por qué 11 y 9 proteínas que se encontraron asociadas de forma conjunta con el estado eosinofílico y neutrofílico del suero, de manera respectiva, en el análisis original no se seleccionaron al considerar estos umbrales alternativos. Al aumentar el número de participantes con recuentos altos de granulocitos, el uso de estos umbrales alternativos también puede aumentar la potencia estadística del estudio, lo que puede explicar por qué el modelo seleccionó con estos umbrales revisados (i) 14 y 13 proteínas que no se seleccionaron en el análisis original del estado eosinofílico y neutrofílico del suero, de manera respectiva, y (ii) una proteína adicional (catepsina G) asociada con el estado eosinofílico del esputo y tres proteínas (CD27, anhidrasa carbónica y CD23), asociadas de manera conjunta con el estado neutrofílico del esputo. Las variaciones en la selección de variables para los diferentes umbrales también pueden sugerir proteínas competidoras o vías distintas relevantes para el asma eosinofílica más baja, lo que sugiere una investigación adicional para explorar qué proteínas se relacionan con vías comunes subyacentes a la eosinofilia y la neutrofilia en suero y/o esputo, y cuáles pueden relacionarse con la gravedad de estos rasgos.
Sin embargo, los análisis de sensibilidad indicaron que PAPP-A (en esputo y suero), e IgE (sólo en suero) se asociaron con la eosinofilia de forma independiente del umbral utilizado, y que MMP 9, catepsina S y BLC se asociaron de manera coherente con la neutrofilia en suero. En general, esto otorga plausibilidad a las vías subyacentes a las que pueden contribuir estas proteínas.
En conclusión, el perfilado proteómico sérico dirigido podría utilizarse para caracterizar los fenotipos eosinofílicos y neutrofílicos de los pacientes con asma y obtener una definición más detallada de estos endotipos mediante la evaluación y cuantificación de la contribución de algunas vías perturbadas (no) establecidas que contribuyen a los fenotipos del asma.
A causa de la gran diferencia en el número de muestras de suero y esputo disponibles, sus desempeños predictivos no pueden compararse de manera directa. Sin embargo, el modelo de suero que se basó en una submuestra de los datos mostró desempeños razonables y las proteínas seleccionadas agregaron información clínica relevante sobre los parámetros clínico-fisiológicos establecidos. Por lo tanto, el perfilado proteómico sérico podría considerarse como una alternativa no invasiva y rentable al perfilado del esputo para la caracterización fenotípica del asma. Sin embargo, a causa de que los perfiles proteómicos basados en sangre pueden afectarse por diferentes órganos, las proteínas que se identificaron pueden reflejar otros procesos fisiológicos (distantes de forma potencial). Si bien los resultados permanecen válidos en términos de estratificación de pacientes, las vías inferidas deben evaluarse de manera cuidadosa, caso por caso en un entorno de tratamiento personalizado.
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y profesor
Dra. Med. María del Carmen Zárate Hernández Profesor
Dra. Marcela Idalhi Villalobos Ordaz Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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