En el asma atópica, la reacción alérgica se desencadena cuando la IgE específica, presentada en la superficie de las células cebadas y los basófilos, se agrupa y entrecruza como resultado de la unión multivalente a epítopos en la proteína alergénica. El entrecruzamiento de la IgE da como resultado la desgranulación, es decir, la liberación de mediadores (por ejemplo, histamina) de las células y la posterior respuesta alérgica del cuerpo (Fig. 1A). Para inducir el entrecruzamiento de la IgE, debe producirse la unión multivalente (es decir, múltiples epítopos en un alérgeno que se unen de manera simultánea a múltiples moléculas de IgE), para hacer que la IgE se agrupe y proporcione la proximidad necesaria para el entrecruzamiento, como se ilustra en la Figura 1. La necesidad de una presentación multivalente de epítopos motivó el desarrollo de nanoalérgenos, una plataforma liposomal para mostrar epítopos alergénicos (Fig. 1B), como se describió de forma previa. Los nanoalérgenos son superiores a los modelos de alérgenos previos y más utilizados, como la albúmina sérica bovina haptenizada, debido a la capacidad de controlar con precisión el tamaño de partícula y la carga de epítopos individuales, o combinaciones de estos, con alta consistencia entre lotes (Fig. 1B, 2A, 2B). La naturaleza multivalente de los nanoalérgenos también es importante para la evaluación de epítopos sintéticos cortos. Cuando un epítopo se presenta como un péptido corto, en lugar de un segmento posicionado de forma natural en un alérgeno intacto (proteína globular), la afinidad entre el epítopo y la IgE es más débil de manera sustancial debido en gran parte al aumento de la entropía conformacional (es decir, el aumento de las conformaciones estructurales) de la secuencia de aminoácidos presentada sin el marco proteico circundante. Esto es importante a considerar de forma particular cuando se comparan epítopos secuenciales (es decir, secuencia continua de aminoácidos en la proteína) frente a epítopos conformacionales (es decir, aminoácidos en proximidad sólo cuando la proteína está plegada de forma correcta), ya que los epítopos conformacionales no pueden imitarse fuera de la estructura alergénica natural sin un andamio para un soporte estructural adecuado. Para superar la afinidad monovalente más débil de los epítopos peptídicos cortos, aquí se optimizó la valencia (es decir, el número de copias de epítopos presentadas en un nanoalérgeno) de los nanoalérgenos variando la carga de epítopos y el tamaño de partícula para aumentar su avidez (afinidad multivalente) por las células presentadoras de IgE. El aumento de la carga de epítopos también podría permitir que ambos brazos FAB en una sola molécula de IgE interactúen de forma bivalve con 2 copias separadas de un epítopo en la superficie de un solo nanoalérgeno, lo que aumenta la avidez por cada interacción IgE-nanoalérgeno y, a su vez, aumenta la avidez general del nanoalérgeno, y lo hace más potente. Además, se proveen partículas de mayor tamaño que acomoden un número mayor de IgE que se unen a un solo nanoalérgeno, lo que resulta en grupos de receptores más grandes lo que en general incrementa la respuesta celular (es decir, la desgranulación). En última instancia, la síntesis de nanoalérgenos más potentes podría permitir la detección de epítopos inmunogénicos de menor afinidad que se pasaron por alto en los ensayos de unión tradicionales.
Las secuencias de epítopos Der p 2 reportadas por la literatura se determinaron mediante estudios que probaron la unión de epítopos, y se basaron, de forma general, en la afinidad de la interacción monovalente epítopo-IgE (uno a uno). Tales ensayos no reflejan las complejidades de las interacciones multivalentes alérgeno-células-IgE in vivo y no se correlacionan de forma directa con una respuesta inmunogénica. Es importante destacar que esta estrategia puede resultar en que se pasen por alto los epítopos de baja afinidad. El sesgo hacia los epítopos de alta afinidad se vuelve problemático cuando se analizan muestras de pacientes, donde la presencia de interacciones multivalentes (es decir, múltiples epítopos que interactúan con múltiples IgE) produce una relación compleja entre la abundancia relativa y la afinidad de cada IgE y la inmunogenicidad de la IgE. En tales casos, los pares de epítopo-IgE de menor afinidad pueden desempeñar un papel crucial, como se reportó de forma previa. De manera específica, debido a la heterogeneidad de IgE en la superficie celular, los epítopos de alta afinidad por sí solos pueden no ser suficientes para desencadenar la desgranulación, mientras que la inhibición de los epítopos de menor afinidad puede ser suficiente para someterla. Debido a estas deficiencias, en la actualidad no hay consenso sobre los principales epítopos del APD ni ninguna información sobre su inmunogenicidad relativa. La plataforma de nanoalérgenos es capaz de evaluar muestras de pacientes en un entorno ex vivo e incorporar interacciones multivalentes para simular con mayor precisión las actividades inmunogénicas desencadenadas por la IgE del paciente. La actividad inmunogénica se puede cuantificar por medio de un ensayo de desgranulación de células RBL (células de leucemia basófila de rata, que son muy adecuadas para el estudio de alergias). En publicaciones previas, se reporta que la plataforma de nanoalérgenos superó las limitaciones de los métodos tradicionales utilizados para identificar epítopos de unión a IgE, y aquí se utiliza un enfoque similar para identificar las inmunogenicidades relativas de los epítopos de Der p 2. Además, se demostró de manera previa que la identificación de epítopos inmunogénicos proporciona información relevante para el desarrollo de nuevos tratamientos, como los inhibidores.
Para determinar los epítopos inmunogénicos de Der p 2, en este estudio, se realizaron ensayos de desgranulación con plasma de pacientes sensibilizados al APD, con nanoalérgenos cargados de forma multivalente con copias de 1 epítopo a la vez (Fig. 1B). También se realizaron ensayos con nanoalérgenos que presentan una combinación de epítopos para evaluar la posibilidad de cooperatividad cuando se presentan epítopos múltiples de manera simultánea. Al probar la capacidad de los epítopos reportados para inducir una respuesta celular, en lugar de confiar sólo en la afinidad de unión, se presenta un método más robusto para la identificación de los epítopos inmunogénicos del alérgeno principal del APD Der p 2. En última instancia, la identificación de porciones inmunogénicas del alérgeno es una herramienta importante para mejorar el tratamiento y las opciones de diagnóstico para las alergias al APD y el asma.
Métodos
Material
Todos los siguientes solventes y reactivos de síntesis de péptidos se compraron a Millipore-Sigma (St. Louis, Missouri): dimetilformamida (DMF), piperidina, diclorometano, N,N-diisopropiletilamina (DIEA), 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorofosfato (HBTU), hidracina, oxima, N,N' -diisopropilcarbodiimida (DIC), éter dietílico, ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano (TIS), isopropanol, acetonitrilo, cloroformo, metanol, colesterol, albúmina sérica bovina, citocalasina D, poli-N-acetilglucosamina, solución salina amortiguada por fosfatos (PBS), ácido palmítico, ácido cítrico, citrato sódico, glicina, cloruro de magnesio hexahidratado, resina NovaPEG Rink Amide LL y todos los aminoácidos protegidos con Novabiochem Fmoc. Fmoc-N-amido-dPEG8-acid y Fmoc-N-amido-dPEG2-acid se compararon a Quanta Bio-Design (Plain City, Ohio). El hidróxido de sodio, el cloruro de sodio y el cloruro de potasio se compraron a VWR (Radnor, Pensilvania). Además, se compraron sal de amonio, membranas y todos los componentes de miniextrusora de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama) 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxi (polietilenglicol)-2000 (DSPE-mPEG2000), membranas y todos los componentes de miniextrusora. Los medios esenciales mínimos, suero bovino fetal, L-glutamina, penicilina-estreptomicina, G418, cloruro de calcio, monohidrato de glucosa e IgE antihumana de cabra se compraron a Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts). La tripsina se compró a Corning (Corning, Nueva York). El plasma del paciente se compró a PlasmaLab International (Seattle, Washington). La IgE humana monoclonal de isotipo la proporcionó el Dr. Scott Smith (Universidad de Vanderbilt).
Análisis estadístico
Todas las barras de error representan DE de triplicados en un solo experimento, a menos que se indique lo contrario. Los datos del ensayo de desgranulación son representativos de varios experimentos. Los valores de medias, DE y P se calcularon con el programa GraphPad Prism (San Diego, California). Los valores de P se calcularon con un análisis de varianza de 2 vías.
Análisis de proteínas
El análisis y estudio de estructuras proteicas cristalinas para la identificación estructural y espacial de epítopos potenciales se realizó mediante UCSF-Quimera, y la estructura cristalina de Der p 2 se obtuvo del banco de datos de proteínas (www.rscb.org).
Síntesis peptídica
Los péptidos se sintetizaron con un sintetizador de péptidos asistido por microondas Liberty Blue o de forma manual en un agitador de acción de muñeca de acuerdo con la química convencional de Fmoc en una resina NovaPEG Rink Amide LL. Las reacciones de desprotección de Fmoc se realizaron con piperidina a 20% en DMF y desprotecciones ivdde con hidracina a 2% en DMF. Los aminoácidos protegidos con FMOC se activaron con DIC y Oxyma en el sintetizador o HBTU y DIEA durante la síntesis manual. Las conjugaciones de ácido palmítico se realizaron de forma mutua con HBTU y DIEA para la activación. Los péptidos se escindieron con cócteles de TFA: H2O: TIS (95: 2.5: 2.5%) o, si los epítopos contenían residuos de cisteína, TFA: H2O: EDT: TIS (94: 2.5: 2.5: 1%). Después del corte, los cócteles TFA se eliminaron por medio de un rotavapor Buchi.
La ciclación peptídica se realizó después de la purificación inicial de los conjugados epítopo-lípido. El polvo conjugado epítopo-lípido se disolvió en 10 ml de DMF y 100 ml de DIEA (por ≤10 mg de producto), y luego se dejó que la solución reaccionara durante la noche a RT con agitación suave. Después de reaccionar, el disolvente se evaporó con un rotavapor, y los conjugados epitopo-lípidos ciclados se repurificaron, como se describe de forma posterior.
Purificación y caracterización de péptidos
Los péptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) en una serie Agilent 1200. Los conjugados péptido-lípidos se purificaron con una columna Zorbax semi-prep C3 y gradiente de isopropanol, acetonitrilo y H2O. Todos los productos se purificaron a más de 90% de pureza. Después de la purificación, la identidad del producto se confirmó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF).
Estructura celular
Las células RBL-SX38 se cultivaron en medios esenciales mínimos con 10% de suero bovino fetal, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 1.2 mg/ml de G418, un agente selectivo para las células RBL que expresan el receptor de alta afinidad de la IgE humana (FcεRI), como se describió de forma previa. Las células se dividieron cada 2 a 3 días. Para los propósitos de este experimento, ninguna célula se mantuvo en cultivo por más de 4 semanas. Las células las proporcionó el Dr. Jean-Pierre Kinet.
Preparación y caracterización de nanoalérgenos
Los nanoalérgenos se prepararon mediante el método de hidratación de película seca, como se describió de forma previa. En viales, los conjugados epítopo-lípido purificados, en las proporciones estequiométricas molares deseadas, se combinaron con lípidos conjugados a granel y polietilenglicol (PEG2000), todos disueltos en disolvente volátil. Los lípidos PEG2000 se agregaron para limitar la agregación de nanoalérgenos y las interacciones no específicas entre nanoalérgenos y células. Para los nanoalérgenos que mostraban múltiples copias de uno o más epítopos de manera simultánea, se utilizó una mezcla lipídica de acuerdo con la fórmula 95 (X + Y + Z):5:X:Y:Z lípido a granel: PEG2000:epítopeX:epítopeY:epítopeZ, donde X, Y y Z variaron de 0 a 8 mol% (Fig. 2B). Se incluyó 5 mol% adicional de colesterol para estabilizar aún más los liposomas. Los disolventes volátiles se evaporaron con un flujo suave de nitrógeno, y luego los viales se mantuvieron en un desecador durante la noche para formar una fina película lipídica seca. Las películas se rehidrataron en PBS por encima de TG (55°C) y se extruyeron a través de filtros de membrana de policarbonato, con poros del tamaño deseado (es decir, 100 o 200 nm). El tamaño del nanoalérgeno se caracterizó con el análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) (Fig. 2C y D), con luz de 658 nm observada en un ángulo fijo de 90°, en un Brookhaven NanoBrook Omni. Los análisis de DLS se realizaron en el Centro de Ciencia y Tecnología Ambiental de la Universidad de Notre Dame.
Purificación de extrusoras liposomales
Para determinar la incorporación de epítopos, los nanoalérgenos se purificaron primero mediante la purificación de la extrusora de liposomas (LEP), como se describió de forma previa. De forma breve, las soluciones de nanoalérgenos se extruyeron a través de membranas de policarbonato de 30 nm a temperatura ambiente, para eliminar cualquier lípido no incorporado. Luego, se evaluaron muestras pre-LEP (antes de la purificación) y post-LEP (purificadas) de cada nanoalérgeno mediante RP-HPLC, y se determinó el área bajo la curva (AUC) del cromatograma de cada uno. Las AUC pre-LEP se incorporaron al 100%; por lo tanto, el porcentaje de incorporación se calculó de la siguiente manera: [AUC post-LEP]/[AUC pre-LEP] x 100%.
Ensayos de desgranulación
Los ensayos de desgranulación RBL se realizaron como se describió de forma previa. Las células RBL se colocan a 50,000 células/ml en una placa de cultivo de 96 pocillos (100 ml por pocillo) y se dejaron unir durante la noche hasta que las células estaban confluentes en la placa. Luego se retira el medio y las células se incuban durante la noche en plasma humano al 10% (v / v) en medios de crecimiento completo. A la mañana siguiente, las células se lavan dos veces con PBS estéril y se reemplazan los medios para eliminar las impurezas y estabilizar las células antes del ensayo. Después de una incubación de 3 horas, las células se lavan dos veces con amortiguador de tiroides y se introducen alérgenos para provocar respuestas de desgranulación. Los pozos de control positivo y negativo se incluyen en cada placa. Los pocillos de control negativo sólo contienen células. Se agregó TritonX o anti-IgE a los pocillos de control positivo. Después de incubar durante 1.5 horas, se introduce el sustrato de poli-N-acetilglucosamina para iniciar reacciones de escisión enzimática de la b-hexosaminidasa. La reacción se detiene con amortiguador de glicina (pH 10.7) después de 1 hora a 37°C. La actividad enzimática se monitoriza y analiza con un lector de placas SpectraMax M2e (l = 405 nm). Todos los ensayos de desgranulación se ejecutan por triplicado. La desgranulación se ilustra como un porcentaje del control positivo.
Se utilizó un grupo control para confirmar que los epítopos causaron desgranulación debido a la interacción con complejos específicos de IgE-FcERI. Para el grupo “Sin IgE”, no se utilizó IgE ni plasma para preparar las células RBL-SX38, sino que sólo se agregaron medios frescos durante la incubación. Para el grupo de “Control de isotipo”, las células RBL-SX38 se prepararon con IgE humana monoclonal específica para cacahuates. Se confirmaron que las células RBL-SX38 preparadas con este anticuerpo no reaccionaron al alérgeno de los ácaros del polvo (Fig. 3B y C). El control del isotipo se utilizó para todos los ensayos, a menos que se indique lo contrario.
Resultados
Diseño, síntesis y caracterización de nanoalérgenos
La plataforma de nanoalérgenos proporciona un medio para evaluar la inmunogenicidad del epítopo con un control preciso sobre la carga de epítopos y el tamaño de partícula con baja variabilidad entre lotes (Fig. 2). La precisión en la estequiometría del epítopo cargado por nanoalérgeno se logra al ensamblar el liposoma a partir de bloques de construcción puros, incluidos los conjugados péptido-lípido presentadores de epítopos (Fig. 2A y B, eFig 1A). Los conjugados epítopo-lípido se produjeron con síntesis de péptidos en fase sólida, con la química Fmoc como se describió de manera previa. Los conjugados se purificaron con RP-HPLC y se caracterizaron con espectrometría de masas cuadrupolo de tiempo de vuelo (eFig 1B, eTable 1). Una preocupación típica, cuando se mostraron péptidos o moléculas pequeñas en una superficie, es que el péptido puede obstaculizarse a sí mismo al quedar enterrado en la región hidrófoba de la bicapa lipídica. Para superar esta preocupación y lograr la máxima eficiencia en la visualización de los epítopos en la superficie del nanoalérgeno, se utilizó un enlazador compuesto de etilenglicol y 3 lisinas (eFig 1A), que mejora la presentación del epítopo a la IgE al mejorar la partición del epítopo en la fase acuosa, como se reportó de forma previa.
Los nanoalérgenos se prepararon a partir de componentes puros (Fig. 2B) mediante el método de hidratación de película seca, como se describió de forma previa. El tamaño del nanoalérgeno se caracterizó con análisis DLS (Fig. 2C y D). Para los nanoalérgenos de 200 nm, el diámetro efectivo de las partículas varió de 150 a 175 nm con baja polidispersidad (<0.17); Los diámetros de partícula efectivos de 100 nm variaron de 95 a 120 nm con polidispersidad inferior a 0.15. El porcentaje de carga de epítopos de más de 80% de incorporación se confirmó mediante análisis RP-HPLC en muestras de nanoalérgenos purificadas con LEP, como se describió de manera previa (eFig. 1C y D).
Análisis cruzado de reportes de la literatura para identificar epítopos alergénicos para una evaluación adicional de inmunogenicidad
Para Der p 2, los estudios de la literatura reportaron epítopos de unión a IgE continuos (secuenciales) y conformacionales (no secuenciales). Las porciones superpuestas de epítopos secuenciales y conformacionales reportados en múltiples fuentes de literatura se identificaron para la evaluación inmunogénica en este estudio. Los epítopos evaluados se destacaron en la estructura cristalina de Der p 2 (Fig. 3A) y se enumeran en la Tabla 1. Se diseñaron y sintetizaron varios epítopos en múltiples configuraciones (es decir, lineal o cíclico; completo o truncado), para evaluar si las diferencias en la estructura conformacional 3D de dichos epítopos, cuando se presentaron fuera del andamiaje de proteínas, tuvieron algún efecto causal significativo sobre su capacidad para unirse a IgE séricas específicas e inducir la desgranulación.
La inmunogenicidad relativa de cada uno de los 11 epítopos sintetizados se determinó con los nanoalérgenos para mostrar los epítopos y realizar ensayos de desgranulación. Los nanoalérgenos se cargaron con un porcentaje molar controlado con precisión (de forma típica 1% -8%) de cada conjugado epítopo-lípido, ya sea al presentar copias de un solo epítopo o una combinación de epítopos múltiples. Se realizaron ensayos de desgranulación con células RBL-SX38 preparadas con plasma del paciente para comparar la intensidad de la desgranulación inducida por los nanoalérgenos.
Verificación de la sensibilidad de la muestra del paciente Der p 2
Hubo 3 muestras de plasma obtenidas de pacientes con alergia a los ácaros del polvo. Debido a que los epítopos de Der p 2 estaban bajo un análisis más detallado, era imperativo verificar que las muestras de pacientes respondieron a las proteínas de los ácaros del polvo y a Der p 2, de forma específica. Los ensayos de desgranulación se realizaron en células preparadas con cada una de las 3 muestras de pacientes y se retaron con concentraciones variables de extracto de ácaros del polvo (Fig. 3B) o Der p 2 purificado (Fig. 3C). Las 3 muestras demostraron desgranulación del extracto, pero sólo los pacientes 1 y 3 demostraron tener IgE específica para Der p 2. Por lo tanto, todos los ensayos futuros reportados se realizaron sólo con los pacientes 1 y 3.
Análisis de inmunogenicidad de epítopo único con ensayo de nanoalérgenos
Para determinar la inmunogenicidad de los epítopos identificados a partir de los reportes de la literatura, cada epítopo se cargó a una valencia optimizada de forma previa de 2 mol% en nanoalérgenos de 100 nm, de modo que los nanoalérgenos presentaron copias multivalentes de un determinado epítopo. La presentación multivalente de un solo epítopo o una combinación de epítopos en la misma plataforma es necesaria para el entrecruzamiento de la IgE y para desencadenar la desgranulación. Las células RBL-SX38 preparadas con plasma de pacientes se retaron con cada uno de los nanoalérgenos que presentaron un solo epítopo (Fig. 3D y E; Control positivo de TritonX, sin control negativo de IgE). Incluso a las concentraciones máximas de nanoalérgenos (1 nM) probadas, no se observó ningún desencadenamiento relevante de la desgranulación de ninguno de los nanoalérgenos que presentaron epítopos individuales. La concentración de nanoalérgenos se limitó a un máximo de 1 nM debido a preocupaciones relacionadas con la especificidad, donde los controles indicaron que algunos nanoalérgenos, a concentraciones superiores a 1 nM, interactuaron de forma no específica con las células y produjeron mediciones potenciales de desgranulación poco fiables (datos no mostrados).
Análisis cooperativo de inmunogenicidad de epítopos con ensayo de desgranulación de nanoalérgenos
Debido a que los nanoalérgenos que presentaron epítopos individuales no revelaron ninguna inmunogenicidad detectable, la cooperatividad entre epítopos se investigó a continuación al presentar los epítopos múltiples de manera simultánea, en combinaciones, en el mismo nanoalérgeno. Con epítopos que son distantes de forma espacial en el alérgeno natural (Fig. 4A y B), se prepararon 2 lotes de nanoalérgenos que presentaron 2 combinaciones separadas de epítopos. Los nanoalérgenos que presentaron la combinación 1, epítopos 2, 5, 7 y 9, no tuvieron desgranulación significativa de manera estadística (P > 0.05) en comparación con el control negativo (Fig. 4C; sin control IgE-negativo). Los nanoalérgenos que presentaron la combinación 2, epítopos 1c, 3, 4 y 8, indujeron la desgranulación a concentraciones de nanoalérgenos de 10 a 1000 pM para ambas muestras de pacientes (Fig. 4D; sin control IgE-negativo). Estos resultados indicaron que 2 o más de los epítopos en la combinación 2 fueron inmunogénicos y que la combinación de epítopos tenía un efecto cooperativo.
Para mejorar la relación señal y ruido del ensayo, se utilizaron los nanoalérgenos de la combinación 2 para optimizar el diámetro del nanoalérgeno y el porcentaje de carga de epítopos para una sensibilidad máxima a la desgranulación con una no especificidad mínima (eFig 2). Para los experimentos posteriores descritos a continuación, se utilizaron nanoalérgenos de 200 nm y una carga total de 4%.
Los nanoalérgenos (péptido total de 200 nm, 4%) cargados con pares de epítopos de la combinación 2 (es decir, epítopos 1c y 3, 1c y 4, 1c y 8, 3 y 4, 3 y 8, 4 y 8), se prepararon y utilizaron en ensayos de desgranulación. El análisis de los resultados con el epítopos par de nanoalérgenos indicó que el epítopo 4 tenía la inmunogenicidad observable más fuerte entre los epítopos de la combinación 2, ya que producía desgranulación cuando se emparejaba con cualquiera de los otros 3 epítopos (Fig. 5B, D, F). El epítopo 1c fue el menos inmunogénico de los 4, sin inducir ninguna desgranulación relevante cuando se emparejó con el epítopo 3 u 8 (Fig. 5A y C). La desgranulación inducida por el par de epítopos 3 y 8 indicó que estos epítopos tienen una inmunogenicidad mayor de forma ligera que el epítopo 1c, ya que el par de epítopos 3 y 8 indujo una desgranulación 2 veces mayor en promedio que 1c y 3 o 1c y 8 (Fig. 5E y G).
Para el paciente 1, a una concentración de nanoalérgenos de 1 nM, los pares de epítopos 1c y 4, 3 y 4, y 4 y 8 lograron una desgranulación de 36% a 44% en comparación con sólo 20% logrado con el par de epítopos 3 y 8 (Fig. 5G). Aunque la respuesta de desgranulación fue 2 a 3 veces menor para el paciente 3 que para el paciente 1, el paciente 3 tuvo tendencias similares en inmunogenicidad.
Los epítopos 1s, 2, 5, 6, 6c y 9 también desencadenaron la desgranulación, en diversos grados, cuando se presentaron en combinación con el epítopo 4. Estos resultados se pueden encontrar en la Figura 6.
DISCUSIÓN
Aquí, se describe cómo se utilizaron los nanoalérgenos para identificar la inmunogenicidad relativa de los epítopos alergénicos de la proteína Der p 2 de los ácaros del polvo. Los resultados de este estudio, en la evaluación de versiones lineales y cíclicas, demostraron que los epítopos secuenciales de Der p 2 no fueron inmunogénicos de forma elevada por sí solos. En cambio, la presentación de combinaciones de epítopos Der p 2 fue necesaria para producir una respuesta celular considerable, lo que sugiere que los epítopos Der p 2 inmunodominantes tuvieron que ser conformacionales. Los nanoalérgenos bien formulados permitieron identificar la inmunogenicidad cooperativa entre los epítopos 1c, 3, 4 y 8 y clasificar los niveles relativos de inmunogenicidad entre estos epítopos. Al final, el epítopo 4 demostró ser el más inmunogénico, seguido por los epítopos 3 y 8, y con el epítopo 1c el menos inmunogénico. El resto de los epítopos reportados por la literatura no mostraron ninguna inmunogenicidad sustancial en el análisis. Cabe destacar que los epítopos identificados a lo largo de este reporte se alinean con los resultados de un estudio que se publicó de manera reciente, que determinó 2 regiones en Der p 2 a las que se une cierta IgE monoclonal humana. De forma especial, una de estas regiones apoya la identificación de los epítopos 3 y 4 como epítopos inmunogénicos, mientras que la otra región se superpone de forma parcial con el epítopo 8. Sin embargo, los estudios previos requirieron evaluaciones complicadas basadas en la resonancia magnética nuclear, que requieren grandes aportes financieros, procesos lentos y recursos difíciles de obtener, como grandes cantidades de IgE monoclonal humana purificada. Sin embargo, la metodología utilizada logró resultados similares con el conjunto heterogéneo de IgE en muestras de pacientes, a un costo mucho menor y sin la necesidad de síntesis de IgE monoclonal humana.
Dada la proximidad de los epítopos 3 y 4 en el alérgeno natural (Fig. 4B), es poco probable que se unan de manera simultánea a 2 sIgE separadas, ya que los obstáculos estéricos evitaron que 2 IgE se unan a 2 sitios muy cercanos. La hipótesis es que el mecanismo por el cual estos epítopos inducen la desgranulación, cuando se presentaron en un nanoalérgeno, se relaciona con uno o más de los siguientes escenarios de unión: (1) porciones de epítopos 3 y 4 pueden unirse de forma simultánea al sitio de unión al antígeno de un solo clon de IgE, análogo a la interacción de una IgE con un epítopo conformacional (Fig. 7A); (2) de manera alternativa, es posible que los epítopos 3 y 4 se reconozcan de manera individual por el mismo clon de IgE, aunque con diferente afinidad para cada epítopo (Fig. 7B); o (3) pueden existir 2 clones distintos de IgE, uno que se une al epítopo 3 y otro que se une al epítopo 4 (Fig. 7C). Si el primer caso era cierto, es posible que el epítopo 3 proporcionara soporte estructural para mantener el epítopo 4 en su conformación adecuada para la unión, o viceversa. Por el contrario, los epítopos 1c y 8 se encuentran más distantes de forma espacial del epítopo 4 en el alérgeno natural; por lo tanto, se espera que los epítopos 1c, 8 y 4 se unan a diferentes sIgE monoclonales (Fig. 7C).
En el caso de los pares de epítopos 1c y 4 y 4 y 8, se cree que el epítopo 4, que es posible que sea un epítopo de mayor afinidad, puede actuar como un ancla (Fig. 7C). Las constantes de velocidad de asociación para las interacciones biomoleculares son independientes en general de la afinidad de unión total (es decir, la constante de velocidad de encendido [kon] debe ser similar para la mayoría de los epítopos). En cambio, las variaciones en las constantes de la tasa de disociación (koff), que incluye la abundancia relativa de cada sIgE en la muestra del paciente, se espera que se correlacionen con el tiempo de residencia del nanoalérgeno que permanece unido a la superficie celular IgE. El epítopo 4 podría servir como ancla al proporcionar tiempo suficiente de residencia para que los complejos receptor-IgE celular se reorganicen y se unan a los otros epítopos en un nanoalérgeno, y promover así el entrecruzamiento e iniciar la desgranulación. Se predice que el emparejamiento de epítopos 3 y 8 actúa de manera similar, ya que estos epítopos también se colocaron en extremos opuestos del alérgeno natural.
Como se reportó en publicaciones previas, la identificación de epítopos inmunodominantes llevó al desarrollo de inhibidores, específicos para la sIgE inmunogénica, que bloquearon o redujeron con éxito la intensidad de las respuestas alérgicas a los cacahuates y los alérgenos farmacológicos. Además, la identificación de epítopos secuenciales inmunogénicos (que pueden ser una parte de, o imitar, epítopos conformacionales) proporciona una ruta más rentable y tecnica para el desarrollo de inhibidores específicos de alérgenos, en comparación con los epítopos conformacionales. Por lo tanto, se predice que comprender y clasificar la inmunogenicidad del epítopo del APD ayudará en el desarrollo de un posible tratamiento preventivo para el asma relacionada con el APD. La extensión de dicha tecnología a la clínica podría traducirse en medicina personalizada, ya que la identificación diagnóstica de epítopos inmunogénicos en pacientes puede permitir el uso de terapias personalizadas para la inhibición de IgE específicas relevantes para la alergia del paciente. El uso de una plataforma como los nanoalérgenos podría determinar a qué epítopos un paciente tiene alergia, con un diagnóstico ex vivo similar a lo descrito en este estudio o como una prueba de punción cutánea. Entonces, la terapéutica específica del epítopo permitiría un tratamiento más preciso y específico de la afección alérgica. Por ejemplo, la identificación de epítopos inmunodominantes puede permitir el desarrollo de inhibidores específicos de IgE, que pudiera tratar las alergias al APD y el asma al bloquear de manera selectiva la unión de IgE a los alérgenos del APD. Otro enfoque potencial sería desarrollar sIgG contra los epítopos inmunogénicos del APD, que pudiera usarse como terapia con anticuerpos monoclonales para capturar alérgenos antes de que pueda ocurrir la interacción de unión entre los alérgenos y la IgE unida a FceRI. No se garantizará que la IgG generada de forma aleatoria a partir del alérgeno original bloquee o supere la unión de la IgE. Por lo tanto, si a un paciente se le administra sólo la IgG específica para los epítopos relevantes, en lugar de una mezcla de IgG de eficacia variable, el costo de la terapia con IgG debería disminuir.
En conclusión, este reporte describió un método novedoso para investigar el asma alérgica al APD a nivel molecular y un nuevo enfoque potencial para el desarrollo de inhibidores para esta afección. De manera indiscutible, cuantos más enfoques alternativos tengan los médicos en su arsenal para tratar el asma y las alergias, mejores serán sus posibilidades de tratar de forma más eficaz la afección y mejorar los resultados de los pacientes.
Original ArticleDetermination of immunogenic epitopes in major house dust mite allergen, Der p 2, via nanoallergens
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dr. Carlos Macouzet Sánchez Profesor
Dr. Daniel Eduardo Verduzco Félix Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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