La infancia, la niñez y la adolescencia son períodos críticos para la maduración del sistema inmune. El desarrollo inmune temprano anormal puede causar trastornos relacionados con el sistema inmune. De hecho, 85% de pacientes con dermatitis atópica (DA) se presentan antes de los 5 años. Aunque los adultos jóvenes tienen un fenotipo de DA diferente al de los pacientes de edad avanzada, se desconocen los cambios inmunitarios en pacientes con DA entre la primera infancia y la edad adulta.
Estudios de sangre que seccionan los cambios del desarrollo desde la infancia hasta la edad adulta son limitados y se centran en subconjuntos de TH1/TH2. Algunos estudios con sujetos control sanos mostraron expansión de los subconjuntos TH1/TH2/T citotóxicas (TC)1 con la edad, mientras que otros no reportaron cambios en los subconjuntos TH2/TC2 durante el tiempo.. Se observó una respuesta inmadura de IFN-γ y frecuencias bajas de células TH1/TC1 en las primeras etapas del desarrollo normal y se describieron relaciones anormales de TH1/TH2 en la sangre del cordón umbilical y lactantes con DA.
Sin embargo, pocos estudios compararon poblaciones pediátricas y adultas con DA, y ninguno comparó de manera directa grupos de edad consecutivos de pacientes con DA con sujetos control de la misma edad, lo cual es fundamental para comprender el desarrollo normal versus patológico de la inmunidad adquirida.
El arsenal terapéutico disponible para pacientes de 0 a 12 años con DA se limita a agentes tópicos, supresores de amplio espectro de la inmunidad sistémica, o ambos. El desarrollo activo de terapias dirigidas para adultos y adolescentes con DA se encuentra en curso y de manera eventual pasará a los niños, al requerir la aclaración de endotipos pediátricos en grupos sucesivos previo a la edad adulta para introducir enfoques dirigidos seguros, efectivos y adaptados a la edad.
Se comparó la activación del subconjunto de células T de memoria y las frecuencias polarizadas del subconjunto CD4/CD8 dentro de los compartimientos dirigido hacia la piel/cutáneo del antígeno linfocitario (ALC)+ y sistémico/ALC- en la sangre de lactantes y preescolares (0-5 años), niños pequeños (6-11 años), adolescentes (12-17 años) y adultos ( >18 años) con DA moderada a grave. Se incluyeron sujetos sanos de control de la misma edad para diferenciar la maduración inmunológica patológica de la fisiológica. Se encontró que las proporciones reducidas de TH1/TH2 se compartían en todas las edades de DA, pero que huellas digitales únicas caracterizan a los grupos de edad de DA individuales, al diferenciarlos de sus pares de edad similar. Los datos de los biomarcadores sanguíneos e intracelulares de las células T agruparon a las cohortes con DA, pero no a los sujetos controles, en 3 fenotipos únicos para la edad, alineados a lo largo de un espectro.
MÉTODOS
Características y muestras de sangre de los pacientes
Se obtuvo la sangre (con la firma del consentimiento informado aprobado por la junta de revisión institucional de padres y pacientes >12 años) de 39 lactantes y preescolares (0-5 años; media de 23 meses), 26 niños (6-11 años; media de 7.5 años), 21 adolescentes (12-17 años; media de 14.9 años) y 43 adultos (mayores o de 18 años; media de 43 años) con DA moderada a grave, así como los sujetos control sanos de la misma edad (24-30 en cada grupo; los datos demográficos y de laboratorio se muestran en la Tabla E1 en el Repositorio en línea de este artículo en jacionline.org). Los análisis de sensibilidad en los subconjuntos de pacientes que se emparejaron para todos los parámetros demográficos arrojaron resultados similares al análisis, incluidos todos los sujetos (ver Tabla E2, A y B, en el Repositorio en línea de este artículo en jacionline.org).
La gravedad de la enfermedad se calificó mediante el uso de las puntuaciones SCORAD para adultos y puntuaciones SCORAD, Puntuaciones de Índice de Gravedad y Área de Eccema (EASI), y Puntuaciones Rápidas para Dermatitis Atópica en menores de 18 años. La Puntuación Rápida para Dermatitis Atópica es una herramienta administrada por los padres que evalúa el involucro y el prurito de 7 partes del cuerpo y se correlaciona de manera elevada con el SCORAD. En sujetos menores de 18 años, el recuento de eosinófilos y la evaluación de la barrera cutánea mediante la pérdida transepidérmica de agua (PTEA) de la piel lesionada y no lesionada del brazo (AquaFlux Modelo AF200; Biox, Londres, Reino Unido) se midieron cuando fue factible. Ningún paciente recibió tratamiento inmunosupresor sistémico dentro de las 4 semanas previas a este estudio, por lo tanto, los datos presentan el fenotipo inmunitario basal de las poblaciones estudiadas. Se registraron las manifestaciones alérgicas concomitantes y los sujetos se clasificaron como tener alergias generales (rinitis alérgica/asma/conjuntivitis alérgica/ambiental), alergia alimentaria, ambas o ninguna. Los sujetos control no tenían antecedentes personales de DA. Sólo un niño y 5 sujetos control adolescentes tenían antecedente de manifestaciones atópicas no cutáneas; sin embargo, el análisis de sensibilidad que excluyó a estos sujetos no alteró los resultados (ver Tabla E2, C).
Aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (CMSPs)
Las CMSPs se aislaron de la sangre con Ficoll-Paque Plus (GE Cuidado de la salud, Uppsala, Suecia). De forma breve, la sangre se coloca bajo un gradiente Ficoll, después de la rotación, se recogieron las CMSPs en la interfaz entre el plasma y el gradiente Ficoll (consulte la sección Métodos en este artículo Repositorio en línea en jacionline.org).
Estimulación de poblaciones de células sanguíneas para las respuestas de citocinas
La activación celular ex vivo se requiere para detectar la producción de citocinas ya que menos de 1% de las células no estimuladas producen citocinas. La sangre completa se incubó con forbol 12-miristato 13-aceteto (25 ng/ml) más ionomicina (2 µg/ml) en presencia de brefeldina A (10 mg/ml) durante 4 horas a 37°C para inducir respuestas de citocinas. Después de la estimulación, se lisaron los glóbulos rojos con solución de lisis FACS para obtener leucocitos (consulte la sección Métodos en el repositorio en línea de este artículo).
Tinción de la superficie celular e intracelular en las CMSPs y células T CD4/CD8 estimuladas y no estimuladas
Las CMSPs se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo para marcadores de superficie celular (CD3, CD8, CD4, CD45RO, CCR7, molécula coestimuladora inducible [ICOS], HLA-DR, ALC, CCR4, CD25 y CD127). Las células sanguíneas estimuladas y no estimuladas también se tiñeron para marcadores de superficie celular (CD3, CD4 y ALC [las células T CD8+ se admitieron por la subpoblación de célula T CD3+ CD4-]) y se permeabilizaron con FACS/perm para teñir las citocinas, como IL-13, IL-22, IL-9, IFN-γ IL-17 (consulte la sección Métodos en el repositorio en línea de este artículo).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa R (R-projets.org). Las medias y medianas se compararon mediante el uso de la prueba t de Welch y la prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney, de manera respectiva. La agrupación jerárquica no supervisada de variables (frecuencias de subconjuntos de células T, edad y puntajes clínicos) se realizó mediante el uso del paquete R ‘‘hclust’’ con un algoritmo de aglomeración McQuitty y coeficiente de Spearman como una similitud métrica y presentada como mapa de calor y un dendrograma. Se construyeron diagramas de dispersión individuales que muestran los coeficientes de Spearman, los IC de 95% y los valores de P para las muestras de pacientes con DA y sujetos sanos de control. Se realizó una agrupación no supervisada de k-medias mediante los componentes principales de las frecuencias de todos los subconjuntos de DA y por separado entre todos los subconjuntos de control sanos. Se encontró que 3 grupos separaron pacientes con DA, pero no sujetos control, a lo largo de un espectro de edad cronológico ANOVA, junto con la prueba de Tukey, se usó para encontrar marcadores que diferenciaran cualquiera de los 2 grupos.
También se realizó un cálculo de potencia basado en un estudio previo de flujo citométrico en pacientes adultos con DA moderada a grave. Se determinó que 39 pacientes con DA tendrían más de 90% de potencia (a un nivel de significancia de .05) para detectar diferencias contra sujetos control en varios subconjuntos de células inflamatorias (CD4+ IL-22+ ALC+, CD4+ IL-3+ALC-, CD8+ IL-17+ ALC+ y células T de memoria central CD8+ [Tmc] y HLA-DR+ ALC+).
RESULTADOS
La citometría de flujo se usó para medir frecuencias de células T polarizadas IFN-γ –, IL-9–, IL-13–, IL-17A– e IL-22–, al definir subconjuntos TH1/TC1, TH9/TC9, TH2/TC2, TH17/TC17 y TH22/TC22 en células T CD4+/CD8+ de forma respectiva. La tinción de la superficie celular se usó para evaluar la expresión de marcadores de activación media (ICOS, coestimulador inducible de células T) y de activación tardía (HLA-DR) en Tmc (CCR7+ CD45RO+) y células T efectoras de memoria (Tem; CCR7-CD45RO+) en compartimientos dirigido hacia la piel/cutáneo/ALC+ y sistémico/ALC-.
Los pacientes y los sujetos control se dividieron en 4 grupos de edad consecutivos (lactantes y prescolares de 0 a 5 años, niños de 6 a 11 años, adolescentes de 12 a 17 años y adultos >18 años). Para mostrar tanto los cambios del desarrollo de sanos versus los patológicos y anormalidades inmunes dentro de cada grupo de edad versus los sujetos control, se presentaron 2 tipos de gráficos de comparación; ambos contienen datos similares, pero se centran en pacientes con DA versus sujetos control para cada grupo de edad o pacientes con DA versus sujetos control de todas las edades.
Las gráficas de comparación presentadas a continuación contienen tanto la media y la mediana ± EE y sus respectivos valores de P para representar mejor el efecto de la distribución del valor. Los resultados discuten los valores de la media, mientras que los porcentajes de la mediana para las principales comparaciones discutidas se presentan en la Tabla E3 en el Repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org.
Expansión de las células T de memoria dirigidas hacia la piel y característica de activación de ICOS en la DA temprana
Las células Tmc y Tem son los componentes principales del sistema inmune adaptativo, al albergar distintas capacidades de referencia. Aunque ambas expresan el marcador ALC dirigido hacia la piel, sólo las células Tmc retienen la positividad CCR7, lo que les permite migrar en los ganglios linfáticos y funcionan como una reserva inmunológica. Después de controlar las células T CD3+ viables al utilizar citometría de flujo, las células CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+ se definieron y analizaron por separado. CCR7 y CD45RO se utilizaron para diferenciar subconjuntos de memoria dentro de las poblaciones CD4 y CD8. CCR7+ CD45RO-definieron las células vírgenes, CCR7+ CD45RO+ definieron las células Tmc, CCR7-CD45RO+ definieron las células Tem y CCR7-CD45RO- definieron células T efectoras/Temra/diferenciadas de forma terminal (ver Figura E1, A-C, en el repositorio en línea de este artículo en jacionline.org). Luego se definió el subconjunto de células Tmc/Tem activadas por ICOS/HLA-DR con el uso de ALC para segregar los subconjuntos dirigidos hacia la piel (ALC+) versus sistémicos (ALC-).
El desarrollo normal se caracterizó por una ligera disminución en frecuencias de células CD4+ ALC+ Tem (pero no Tmc) entre la infancia y niñez (lactantes: 26.7% vs niños: 19%, P =.01; Figura 1, A y B, y ver Figura E1, D y E), pero esta disminución fue más evidente de manera significativa en pacientes con DA (P <.05; Figura 1, A y B, y ver Figura E1, D y E). Los recuentos de células Tem/Tmc CD4+ ALC+ fueron mayores de manera significativa en lactantes con DA (células Tmc: 20.4% vs 13.4%, P=.006; células Tem: 38% vs 26,7%, P =.002; ver Figura E1, D y E) y niños con DA (Células Tcm: 18.8% vs 11.3%, P = .01; Células Tem: 27.7% vs 19%, P = .03; ver Figura E1, D y E) que en sujetos control, una diferencia que disminuyó con el aumento de la edad. Las fluctuaciones del subconjunto de células T de memoria con la edad se presentan en la figura E2 en el repositorio en línea del artículo en www.jacionline.org. Debido a las proporciones incrementadas de células efectoras y vírgenes, las frecuencias del subconjunto de células CD8+ Tmc/Tem disminuyeron entre la infancia y la niñez de manera exclusiva en los sujetos control (células Tcm: 12.8% [lactantes] vs 5.6% [niños], P = .008; células Tem : 15.4% [lactantes] vs 5% [niños], P <.001; Figura 1, C y D), lo que condujo a frecuencias más altas en niños con DA (P <.01), pero por lo demás, las frecuencias fueron en general similares entre pacientes con DA y sujetos control a lo largo del tiempo (ver Figura. E1, F y G). Un aumento significativo de las células efectoras CD4+/CD8+ con la edad caracterizó a los pacientes con DA versus sujetos control, que mostraron una disminución en este subconjunto durante el estudio (ver Figura E2, J y L).
Los niveles de ICOS de Tcm/Tem CD4+ en activación media aumentaron de manera continua tanto en sujetos control como en pacientes con DA; sin embargo, disminuyeron de forma significativa entre la adolescencia y la edad adulta de manera exclusiva en sujetos control (células Tcm ALC+: 24% frente a 9%, P =.003; células Tmc ALC-:9.2% vs 3.7%, P =.001; Figura 1, E-H). Ambas frecuencias de células T CD4+ activadas por ICOS, las dirigidas a la piel/ALC+ y las sistémicas/ALC-, se incrementaron de manera significativa en lactantes y adultos con DA versus sus respectivos sujetos control (P <.05; Figura 1, E-H). La activación por ICOS de las células Tmc/Tem CD8+ dirigidas hacia la piel se incrementó de forma gradual, de manera más notable en los pacientes con DA (Figura 1, I-L), con diferencias únicas en la frecuencia vistas en adultos con DA versus sujetos control (células Tcm: 18.4% vs 12.5%, P =. 01; células Tem: 26% vs 13,4%, P <0,001; Figura 1, I-L).
El antígeno HLA-DR, que indica activación crónica, tuvo expresión similar (o incluso menor) en lactantes con y sin DA (P > .1; ver Figura E1, H-K) pero comenzó a aumentar en niños con DA (DA Tmc+ CD4+ ALC+: 15.8% vs 8.4%, P =.02; ALC-: 7.2% vs 2.8%, P =.06; ver Figura E1, H-I), para alcanzar niveles altos de manera consistente de células Tmc/Tem/CD4+/CD8+/ALC+/ALC- en adultos con DA comparado con sujetos sanos (P <.05; no se muestran los datos de células Tmc/Tem CD8+; ver Figura E1, H-K).
La disminución de la relación TH1/TH2 caracteriza la DA a lo largo de las edades
Debido a que la activación de las células T conduce a la polarización de las citocinas, a continuación se estudiaron diferentes subconjuntos de células T polares. Los gráficos representativos de citometría de flujo y la estrategia de activación se presentan en la figura E3 en El repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org. De forma congruente con publicaciones anteriores, los niveles de IFN-γ aumentaron con la edad tanto en sujetos control como en pacientes con DA, con las frecuencias más bajas observadas en lactantes (Figura 2, A-D). Sin embargo, en pacientes con DA, el IFN-γ no alcanzó niveles de control, de manera particular dentro del compartimento dirigido hacia la piel (CD4+ ALC+: 12% [lactantes de control] vs 7.7% [lactantes con DA], P =.04; 19.5% [niños control] vs 13.6% [niños con DA], P = .05; 18% [adolescentes control] vs 13% [adolescentes con DA], P = .07) hasta la edad adulta (P =.2; Figura 2, A-D, y ver Figura E4, A-D, en el repositorio en línea de este artículo en jacionline.org). Incluso en la edad adulta, los niveles tendieron a frecuencias más bajas. De forma interesante, la única población que mostró niveles más bajos de IFN-γ sistémico/ALC- CD4+/CD8+ fue el grupo de edad de 5 a 12 años (CD4+: 20% [sujetos control] vs 14% [pacientes con DA], P = .04; CD8+: 39% [sujetos control] vs 28% [pacientes con DA], P = .05; ver Figura E4, B y D).
En los sujetos control, los niveles de IL-13+ CD4+ ALC+ fueron más bajos en lactantes, al alcanzar una meseta en la infancia. Por el contrario, en pacientes con DA, los niveles aumentaron de manera similar en todas las edades (P >.1; Figura 2, E). Los recuentos de células TH2 sistémicas/ALC- fueron en general bajos en sujetos control (Figura 2, F). Los recuentos fueron más altos de forma significativa en pacientes con DA que en sujetos control entre niños (2.8% vs 0,6%, P =.005; ver Figura E4, F), adolescentes (1.5% vs 0.7%, P = .006; ver Figura. E4, F) y adultos (1.3% vs 0.7%, P =.005; ver Figura E4, F). Aunque los recuentos de células TC2 fueron mayores de forma ligera en niños con DA versus los que no tenían DA, las diferencias en los subconjuntos CD8+ fueron más prominentes en la edad adulta (Figura 2, G y H, y ver Figura E4, G y H). Como reflejo del desequilibrio TH1 y TH2 que caracteriza la DA, la relación TH1/TH2 se redujo en pacientes con DA comparada con los sujetos control en ambos subconjuntos ALC+/ALC- entre las edades. Los recuentos de células TC1/TC2 fueron más bajos de forma significativa en niños y adultos con DA versus sujetos control (Figura 2, I-L, y ver Figura E4, I-L).
Tanto los sujetos control sanos como los pacientes con DA tuvieron aumento del recuento de células TH9 con el tiempo, alcanzaron su punto máximo en la adolescencia y disminuyeron en la edad adulta (Figura 3, A y B, y ver Fig. E5, A y B, en el repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org). No se observaron diferencias en el nivel de TH9 entre pacientes con DA y sujetos control, con la excepción de niños de 5 a 12 años con DA que mostraron un aumento significativo de niveles de CLA- (0.76% vs 0.3%, P = .04; ver Figura E5, B). Este grupo de edad con DA también mostró un aumento en el recuento de células TC9 ALC+/ALC- (Figura 3, C y D, y ver Figura E5, C y D). Los recuentos de células TH17 ALC+ fueron en general estables y abundantes de forma similar entre las edades entre sujetos control y pacientes con DA (Figura 3, E, y ver Figura E5, E), contrario a los recuentos de células TH17 ALC-, que mostraron expansión del desarrollo en ambos (Figura 3, F, y ver Figura E5, F). A diferencia de los adolescentes con DA, que tenían recuentos más bajos de células TC17 ALC+ que los sujetos control (1% frente a 4.7%, P = .04), los adultos tuvieron frecuencias más altas de forma significativa (2.1% vs 1.4%, P =.05; Figura 3, G y H, y ver Figura E5, G y H).
El recuento de células sistémicas/ALC- CD4+/CD8+ IL-22+ aumentó de forma similar con la edad tanto en sujetos control como en pacientes con DA (Figura 3, J y L, y ver Figura E5, J y L), mientras que los recuentos de células TH22/TC22 dirigidas hacia la piel aumentaron con la edad principalmente en pacientes con DA (Figura 3, I y K, y ver Figura E5, I y K). Al comenzar por la infancia, el recuento de células TH22/TC22 dirigidas hacia la piel fue mayor de manera significativa en pacientes con DA frente a sujetos control e incrementaron con la edad (células TH22: niños, 6.7% vs 4%, P = .07; adolescentes, 7.9% vs 3.6%, P = .001; adultos, 8.2% vs 4.4%, P <.0001; Figura 3, I y K, y ver Figura E5, I y K). El desarrollo del subconjunto de células T polares en sujetos control y pacientes con DA se resume en la Tabla E4 en el Repositorio en línea de este artículo en jacionline.org y se muestra en el resumen gráfico.
El mapa de calor de agrupamiento jerárquico no supervisado en la Figura 4 resume lo anterior, y muestra todos los subconjuntos de células T polarizadas para sujetos control y pacientes con DA en todos los grupos de edad (rojo, positivo/aumento; azul, negativo/disminución). Los cambios de las frecuencias medias de pacientes con DA frente a sujetos control para cada grupo de edad se presentan. El grupo verde incluye subconjuntos que eran bajos y estables de forma relativa entre los sujetos control pero que aumentaron de manera gradual con la edad en pacientes con DA. La mayoría de estos subconjuntos aumentaron de manera significativa en adultos con DA frente a sujetos control (FCH >1.57, P <.05), mientras que los pacientes más jóvenes con DA mostraron una significancia menor o nula. El cuadro rosado muestra el aumento de las frecuencias de la IL-9 en la infancia, que disminuyen en la edad adulta, en particular en pacientes con DA. Los grupos amarillos muestran marcadores que aumentaron en ambos, sujetos controles y pacientes con DA, al minimizar la diferencias entre grupos.
Activación de células T, medidas clínicas y niveles de IFN-γ se asociaron con la edad y la cronicidad de la DA
También se evaluó cómo las características clínicas, como la gravedad de la DA (puntajes SCORAD y EASI), la edad del paciente, la duración de la enfermedad, el recuento de eosinófilos, el prurito y la pérdida transepidérmica de agua (PTEA) se relacionan con diferentes subconjuntos de células T polares. La agrupación jerárquica no supervisada de todas las frecuencias de subconjuntos de células T, puntuaciones clínicas, duración de la DA y edad se realizó mediante correlaciones de Spearman como una métrica de similitud, como se muestra en el mapa de calor de correlación y dendrograma en la Figura 5 (rojo, correlación positiva; azul, correlación negativa; las estrellas y los signos positivos muestran significancia). Congruente con datos recientes de DA que mostraron correlaciones positivas entre células T productoras de IL-13 e IL22, e IL-17 e IL-22, estas citocinas se agruparon juntas en gran medida. Las células T productoras de IFN-γ se agruparon junto con duración de la DA y la edad del paciente. Se colocó un grupo estrecho que reunía múltiples medidas clínicas adyacentes a las células T productoras de IL-9/IL-13. Las correlaciones significativas representadas en este mapa de calor se enumeran en la Tabla E5 del Repositorio en línea de este artículo en jacionline.org, con diagramas de dispersión individuales seleccionados presentados en las figuras 6 y 7 y las figuras E6 a E8 en el Repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org..
Las puntuaciones SCORAD y EASI se correlacionaron de forma positiva (r = 0.74, P <.001; Figura 6, A). Los puntajes de SCORAD también se correlacionaron con recuentos de células CD4+ dirigidas hacia la piel (r = 0.24, P = .0016; Figura 6, B), prurito (r = 0.54, P <.0001; Figura 6, C) y recuento de eosinófilos (r = 0.25, P = .001; Figura 6, D). Para evaluar el desarrollo normal frente al patológico con la edad, se evaluaron de manera exhaustiva las correlaciones de las edades en sujetos control y pacientes con DA, se presentaron ambos en los mismos diagramas de dispersión para mayor claridad, cuando era aplicable. La edad se correlacionó de forma positiva con la gravedad según los puntajes SCORAD (r = 0.25, P = .0016; Figura 6, E) y EASI (r= 0.34, P <0.001; Figura 6, F) y con todas las demás medidas clínicas, que incluyen el prurito (Figura 6, G), el recuento de eosinófilos (Figura 6, H) y la PTEA lesional (Figura 6, I y J).
Aunque los recuentos de células Tmc/Tem dirigidas hacia la piel se correlacionan de forma negativa con la edad (Figura 6, K y L; rojo, pacientes con DA; azul, sujetos control), la proporción de las células T dirigidas hacia la piel activadas por ICOS y HLA-DR aumentaron de manera exclusiva en pacientes con DA (ver Figura E6, A-D). La duración de la DA, que correlaciona muy bien con la edad del paciente (r = 0.98, P <.0001; ver Figura E6, E), también demostró correlaciones positivas significativas con la puntuación EASI y el prurito (ver Figura E6, F-H). Entre los subconjuntos de citocinas (ver Figura E6, I-L), la correlación más significativa se observó entre la duración de la DA y los recuentos de células productoras de IFN-γ (r = 0.58, P <.0001; ver Fig. E6, L).
En general, los niveles de IFN-γ aumentaron con la edad en pacientes con DA y sujetos control (ver Fig. E7, A-D); sin embargo, aunque la proporción TH1/TH2 (pero no TC1/TC2), de forma particular su componente dirigido hacia la piel, aumentó con la edad en ambos grupos, se mantuvo disminuida de forma significativa en pacientes con DA en todas las edades comparado con los sujetos control (Figura 7, A-D). Por el contrario, las diferencias entre pacientes con DA y sujetos control se observaron en el recuento de células TH2/TC2 dirigidas hacia la piel durante el desarrollo, donde los sujetos control nunca alcanzaron los niveles observados en los pacientes con DA (Figura 7, E-H). Los recuentos de células TH22/TC22 ALC+ mostraron aumentos de desarrollo más altos de manera significativa en pacientes con DA (Figura 7, I y K), mientras que los subconjuntos sistémicos en general se superpusieron (Figura 7, J y L). Se observaron tendencias negativas similares de las células IL-9+ (ver Figura E7, E-H) y la expansión de células TH17 sistémicas en sujetos control y pacientes con DA (ver Figura E7, I-L).
Se registraron correlaciones positivas entre las puntuaciones SCORAD y las células productoras de IL-13, IL9 y IL-22 (P <.02; ver Figura E8, A-C, en el repositorio en línea de este artículo en www.jacionline.org). Las puntuaciones EASI se correlacionaron con los recuentos de células TH9 y TH22 y el prurito (P <.03; ver Figura E8, D-F), mientras que el prurito se asoció con células TH22 y recuentos de eosinófilos (P <.032; ver Figura. E8, G y H). La PTEA se correlacionó con los recuentos de células CD4+ ALC+ sólo en piel no lesional (Figura E8, I y J). Los recuentos de células TH22 se correlacionaron de forma positiva con la PTEA en tejidos lesionales (ver Figura E8, K y L), y la gravedad de la DA se correlacionó con la PTEA en piel no lesional (ver Figura E8, M-P).
Debido a que la tinción de la caja de tenedor P3 (FOXP3) requiere permeabilización de la célula, se utilizaron marcadores de superficie para la identificación de células T reguladoras (Treg). Noventa por ciento de las células CD25+ CD127- CCR4+coexpresan FOXP3 y, por lo tanto, el fenotipo CD25+ CD127- CCR4+ definió las células Treg. En el análisis de las células Treg, se capturaron tanto las células Treg totales (CD25+ CD127-) como las células Treg dirigidas hacia la piel (fracción CCR4+ CLA+). El único grupo de edad de DA que mostró un aumento significativo tanto en las células Treg totales (ver Figura E9, A, en este artículo en línea Repositorio en jacionline.org) y las dirigidas hacia la piel (ver Figura E9, B) versus los sujetos control fue el grupo de 5 a de 12 años (P <.01). En el desarrollo, los pacientes con DA mostraron tendencias similares de células Treg totales a las de los sujetos control, mientras que las discrepancias fueron más evidentes en los subconjuntos dirigidos hacia la piel (ver Figura E9, C y D).
La polarización de las citocinas y la activación de las células T diferencian a los pacientes con DA en grupos de edades separados a lo largo de un espectro
Se integraron biomarcadores de células T y citocinas para diferenciar la cohorte completa de DA de acuerdo con su fenotipo sanguíneo. Los componentes principales de todos los datos de biomarcadores para todos los sujetos se analizaron por separado mediante el uso de grupos de k-media no supervisada para pacientes con DA y sujetos control. Como se muestra en la figura 8, en la cohorte de DA las frecuencias de diferentes marcadores definieron 3 grupos significativos alineados a lo largo de un espectro. Aunque los bebés se agruparon en el extremo izquierdo, los niños y adolescentes se agruparon por lo general entre los bebés y los adultos. Los marcadores que mejor distinguieron cada conjunto de grupos aparecen en los cuadros entre las 2 cohortes y se resumen en la Tabla E6 de este artículo en el Repositorio en línea en jacionline.org. La relación TH1/TH2, la activación de CD8+ y los recuentos de células T productoras de IFN-γ diferenciaron a los adultos de los grupos más jóvenes. Las células Treg, la activación de células T, y los diferentes subconjuntos de citocinas fueron capaces de diferenciar los distintos grupos de edad en la DA. Al aplicar el mismo modelo a la población control, no distinguió entre grupos de edad (Figura 8).
DISCUSIÓN
Éste es el primer estudio exhaustivo con que compara los perfiles inmunes sistémicos de diferentes grupos de edad en pacientes con DA (0-5, 6-11, 12-17 y >18 años) con comparaciones apropiadas con sujetos control. Debido a que las células T circulantes ALC+ se sugieren como biomarcadores periféricos en pacientes con DA, se utilizó ALC para segregar entre los cambios inmunes dirigidos hacia la piel y sistémicos que acompañan el desarrollo en sujetos sanos y pacientes con DA. Los datos sugieren endotipos únicos en bebés, lactantes, niños, adolescentes y adultos con DA, y es posible que aboguen por enfoques personalizados basados en endotipos en lugar de estrategias terapéuticas de “talla única para todos”. De manera adicional, los resultados comienzan a definir diferencias específicas por edad entre los pacientes pediátricos con DA y sujetos control de la misma edad como complemento a los datos recientes al mostrar diferencias entre los endotipos de adultos mayores frente a adultos jóvenes con DA. Estos datos sugieren que incluso los adolescentes tienen un perfil diferente al de los adultos, lo que es posible que contribuya a la respuesta algo más baja al antagonista del receptor alfa de la IL-4, dupilumab, aprobado de manera reciente, en adolescentes frente a adultos.
Las respuestas inmunitarias al nacer son inmaduras, con disminuciones en las frecuencias de células T vírgenes en niños sanos con aumentos paralelos a la edad con incremento en el recuento de células Tmc/Tem. Los recuentos de células Tmc/Tem dirigidas hacia la piel son más altos en lactantes y niños con DA comparado con sujetos control y disminuyen con la edad de manera exclusiva en pacientes con DA. El aumento en el recuento de células de memoria dirigidas hacia la piel en bebés con DA de forma separada de los otros grupos de edad, sugiere relevancia temprana. El cambio excesivo de virgen a memoria, que causa una afluencia de células de memoria en la circulación en el periodo de la lactancia y la infancia temprana, podría desempeñar un papel en el inicio de la DA, mientras que las disminuciones exclusivas en la población de DA a lo largo del tiempo podrían sugerir una mayor migración de células Tmc/Tem ACL+ a la piel.
ICOS se involucra en múltiples respuestas inmunes adaptativas, que incluyen la inducción la polarización de varias de células T, la regulación de células Treg, la respuestas de anticuerpos (incluido el cambio de IgE), y la producción de citocinas mediada por células linfoides innatas (CLI) del grupo 2. ICOS también se involucra en la patogénesis del asma. De manera previa, se demostró que la activación por ICOS de las células Tmc/Tem es más alta en niños con DA frente a niños controles. Los datos posteriores mostraron una activación por ICOS acelerada de células T sistémicas/ALC- en niños de 0 a 3 años con DA. Los datos de este trabajo apoyan la expansión de ICOS en el desarrollo de sujetos sanos y pacientes con DA, en particular en las células T CD4+. Sin embargo, se observaron correlaciones positivas con la edad de forma exclusiva en pacientes con DA y de manera específica en subconjuntos de memoria dirigidos hacia la piel.
Además, lactantes y adultos con DA tienen activación más alta de ICOS CD4+ ALC+/ALC- que los sujetos control, una diferencia que también es importante para los subconjuntos de células CD8+ en niños. Las frecuencias bajas de células CD8+ en lactantes, que aumentan con el tiempo, podrían explicar la activación más temprana de los subconjuntos CD4+. La participación temprana de ICOS en pacientes con DA indica su posible papel en la inducción de la enfermedad mediante la estimulación de polarización del subconjunto células T, la modulación de células Treg, la inducción de IgE o la activación de las CLI del grupo 2. Además, la elección como blanco del ligando ICOS/ICOS en un modelo de ratón con asma alteró la diferenciación de las células T y mejoró el asma. Debido a que la DA a menudo precede al asma, la expansión ICOS ALC- en bebés con DA también podría asociarse con manifestaciones atópicas no cutáneas. Estos datos sugieren el potencial para la elección como blanco de ICOS como un enfoque preventivo o terapéutico para la DA y las asociaciones atópicas, aunque esto es especulativo, y se necesitan más estudios.
La activación crónica del antígeno HLA-DR del CMH clase II de las células T aumenta con la edad en sujetos sanos. La activación de HLA-DR se demostró en adultos con DA crónica. Aunque sus niveles no aumentan en bebés con DA, su activación aumenta con edad.
Al nacer, las respuestas inmunitarias se encuentran sesgadas por TH2, con niveles bajos de TH1/IFN-γ tanto en recién nacidos sanos como en aquellos que de forma eventual tienen DA. Estos datos muestran que las frecuencias TH1 aumentan con la edad en bebés con DA y bebés de control. Sin embargo, en congruencia con datos sanguíneos recientes, pacientes con DA tienen frecuencias de IFN-γ más bajas de forma significativa que los sujetos control, en particular entre los subconjuntos CD4+ ALC+. Por el contrario, los recuentos de células ALC+ TH2 se encuentran aumentados de manera similar en todos los grupos de edad con DA y son de manera significativa, más altos que en los sujetos control, incluso en lactantes. Los recuentos de células TH2 sistémicas/ALC- son más altos de forma significativa en pacientes con DA que comienza en la infancia, lo que implica la activación TH2 sistémica con mayor cronicidad. De acuerdo con el menor papel dominante de CD8 sugerido en niños con DA temprana y la abundancia baja de CD8 en bebés, los aumentos de células TC2 son prominentes en su mayoría en adultos con DA. La correlación de la relación TH1/TH2 ALC+ con la edad disminuye de forma constante en pacientes con DA comparada con los sujetos control, y la disminución de la relación ALC+/ALC- TH1/TH2 entre todos los grupos de edad con DA refleja de mejor manera el desequilibrio inmune que acompaña a la DA desde el nacimiento hasta la edad adulta.
Las células TH9 circulantes tienen predilección dirigida hacia la piel. Los niveles de la IL-9 aumentan tanto en la piel como en el suero de los niños con DA y también se correlacionaron con la gravedad de la enfermedad. Aunque se desconoce el mecanismo por el cual la IL-9 contribuye a la DA, la IL-9 se vincula a la función de células cebadas, eosinófilos y CLI y se considera que desempeña un papel importante en los pacientes con DA, así como en pacientes con otras enfermedades atópicas. En consecuencia, los subconjuntos de la IL-9 se agrupan más cerca a todas las medidas clínicas de la DA (recuento de eosinófilos/prurito/puntaje SCORAD/puntuación EASI/PTEA). El desarrollo tanto en sujetos sanos como en pacientes con DA se caracteriza por un aumento del nivel de la IL-9 con la edad, que disminuye en la edad adulta. Se muestra un aumento mayor de forma considerable en el recuento de células T sistémicas/ALC- de forma exclusiva entre el grupo de 5 a 12 años con DA frente a sujetos control, consistente con el desarrollo temprano de alergia en la infancia y una disminución posterior en la edad adulta. La activación sistémica ALC- y la polarización de citocinas con la edad apoyan la naturaleza sistémica de la DA y la necesidad de enfoques terapéuticos sistémicos en pacientes con enfermedad moderada a grave, así como la asociación de comorbilidades y aumento de las proteínas inflamatorias asociadas a enfermedades cardiovasculares en pacientes con DA más crónica.
Black y colaboradores demostraron un fuerte sesgo TH17 temprano en la vida. Aunque observaron frecuencias similares de TH17 ALC+ en lactantes y sujetos mayores de forma independiente de la DA, los recuentos de células TH17 sistémicas/ALC- son bajos de forma relativa en bebés de ambos grupos y maduran con tiempo. Las señales de la IL-17 caracterizan la piel de los pacientes con DA, pero estos cambios no se reflejan en la circulación. Esta discrepancia podría deberse al aumento en la residencia en la piel de células TH17 o a la regulación periférica recíproca de los ejes TH17 y TH2.
Los niveles de TH22 dirigidos hacia la piel aumentan en niños, adolescentes y adultos con DA frente a los sujetos control. Congruente con estudios anteriores que muestran que la IL-22 se correlaciona con la gravedad de DA, se presentaron correlaciones positivas entre células CD4+ productoras de IL-22, puntuaciones SCORAD, puntuaciones EASI, y prurito. Las células T CD8+ son las principales productoras de IL-22 en la piel de adultos con DA. Proporciones más bajas de células CD8+ frente a CD4+ en la infancia temprana y el hecho de que la IL-22 marca la cronicidad de la DA podrían explicar por qué son más altas las frecuencias de células TH22/TC22 dirigidas hacia la piel en adolescentes y adultos. Los niveles aumentados de la IL-22, que se demostró que disminuyen la expresión de IFN-γ, también podrían contribuir a las frecuencias bajas de TH1 observadas en pacientes con DA. El desarrollo del subconjunto TH22/TC22 sistémicas/ALC- fue similar en pacientes con DA y sujetos control, lo que sugiere de forma potencial una mayor relevancia patogénica de la IL-22 en la piel de pacientes con DA y una barrera cutánea deteriorada. Los estudios demuestran correlaciones positivas y coproducción celular de IL-13 e IL-22 y de IL-17 e IL-22. De hecho, estos marcadores se agrupan en el mapa de calor de correlación. IFN-γ se agrupa con la edad del paciente y la duración de la enfermedad, al diferenciar los lactantes de prescolares y adolescentes y adolescentes de adultos con DA. La asociación de IFN-γ con la cronicidad de la enfermedad concuerda con datos previos de DA crónica en adultos, lo que sugiere posiblemente que el IFN-γ desempeña un papel en la cronicidad del trastorno inflamatorio más que en el inicio de la enfermedad. La expansión de las células de memoria CD8+, los incrementos en las células productoras IL-22 ALC+, y la intensificación de la activación ICOS+/HLA-DR+ con la madurez podrían explicar las correlaciones positivas entre la edad, la duración de la enfermedad y las medidas de gravedad.
La gravedad creciente con la edad no se observó en un estudio reciente que siguió a los bebés entre 0 y 11 meses con DA. La PTEA aumenta con la edad en pacientes con DA y se correlaciona con la IL-22 (que también aumenta con la edad), es probable que de nuevo refleje la contribución de la IL-22 al deterioro de la barrera en pacientes con DA.
Además de mantener la tolerancia inmune, las células Treg influyen en la activación de las células efectoras. Sólo los niños con DA de 5 a 12 años tienen de forma significativa más células Treg dirigidas hacia la piel que los sujetos control. Este grupo de edad se distingue por otras características únicas, que incluyen mayor recuento de células Tmc/Tem dirigidas hacia la piel, disminución de los niveles sistémicos de IFN-γ y aumento de las frecuencias de IL-9 sistémica. De manera adicional, los niveles de IFN-γ dirigido hacia la piel casi se duplican desde la infancia hasta la niñez en pacientes con DA, aunque todavía son más bajos que los de los sujetos control de la misma edad. Múltiples cambios inmunológicos que ocurren durante estos años podrían involucrarse en el aclaramiento de la DA o el desarrollo de manifestaciones no cutáneas que ocurren de manera común durante estos años.
El perfil de DA a lo largo de las edades es imprescindible para el desarrollo terapéutico dirigido. A diferencia de la psoriasis, en la cual los tratamientos dirigidos conducen a respuestas notables en la mayoría de los pacientes, la respuesta de la DA a la terapéutica dirigida es mucho más baja. Esta disparidad puede atribuirse a la activación multicitocina observada en pacientes con DA, a pesar de la activación TH2 compartida, frente a la respuestas centradas en TH17 en pacientes con psoriasis. Además, la DA tiene un repertorio muy variado de endotipos, con diferentes polarizaciones inmunes. A pesar de las características comunes, en particular la expresión aumentada de TH2, la DA es diferente en cuanto a endotipos según las edades, y los tratamientos deben adaptarse al endotipo único para la edad. Aunque se podría plantear la hipótesis que los cambios inmunes sólo reflejan los fenómenos del desarrollo relacionados con la edad, la falta de agrupación clara en los sujetos control implica que la DA es el impulsor de las características endotípicas distintas, progresivas y relacionadas con la edad en lugar de la edad sola. El modelo de agrupamiento, basado en biomarcadores de citometría de flujo, divide a la cohorte en 3 grupos separados de edad sólo en pacientes con DA. Como era de esperar, los niveles de IFN-γ, IL-22 y HLA-DR aumentaron de forma cronológica, y distinguieron sujetos mayores de lactantes con DA. Los recuento de células Tmc/Tem dirigidas hacia la piel y la activación sistémica por ICOS, los cuales eran más altos en lactantes con DA, separaron a los lactantes de otros grupos. Este modelo demuestra que un grupo limitado de biomarcadores sanguíneos puede distinguir entre varios endotipos de DA de acuerdo con la edad del paciente, con un espectro de fenotipos dependientes de la edad versus sólo “infantil” o “adultos”. Debido a que los datos muestran que el fenotipo de DA “adulto” o “estable” sólo se alcanza en la edad adulta, podría ser posible intervenir antes de la edad adulta y evitar el establecimiento del fenotipo adulto de la DA.
Este estudio tiene algunas limitaciones. A pesar de la inclusión de diferentes grupos de edad, este estudio no fue longitudinal y por lo tanto no se siguió a la misma cohorte con el tiempo. Además, los estudios en sangre no permitieron medir subconjuntos de células T en la piel, como las células T de memoria residentes de tejidos. Además, el estudio caracterizó las respuestas policlonales de las células T y no las respuestas específicas al antígeno inducidas por los desencadenantes culpables. Por último, la patogenicidad de los ejes inmunes presentados aquí no se puede diseccionar más sin futuros estudios terapéuticos dirigidos para verificar los mecanismos.
La DA se consideró de manera inicial una enfermedad pediátrica de inicio temprano, donde 75% “supera” su enfermedad a la edad de 10 años. Estudios más recientes establecen a la DA como un trastorno que a menudo persiste en la edad adulta. Comparar el perfil de la DA pediátrica resuelta versus persistente, de manera ideal mediante estudios longitudinales, definirá mejor las características específicas de la edad que predicen la resolución de la DA.
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Rosalaura Villarreal González Profesor
Dra. Wendy Jarely Santos Fernández Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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