1 | INTRODUCCIÓN

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad de la mucosa nasal mediada por IgE y se caracteriza por estornudos, rinorrea hialina y congestión nasal. Los alérgenos más importantes de la RA estacional son los pólenes, mientras que los de la perenne son los ácaros del polvo doméstico (APD): Dermatophagoides pteronyssinus y Dermatophagoides farinae. En individuos sensibles, los antígenos inhalados se unen a los anticuerpos IgE en los mastocitos y los basófilos y dentro de minutos se liberan mediadores químicos como la histamina, la prostaglandina D₂ (PGD₂) y los leucotrienos cisteinílicos (cysLTs) como parte de la respuesta de fase temprana. Estos mediadores estimulan las terminaciones nerviosas y las células endoteliales de los vasos sanguíneos para provocar estornudos, rinorrea hialina y edema de la mucosa. Varias células inflamatorias como los eosinófilos activados se infiltran en la mucosa nasal en respuesta a los mediadores químicos liberados durante la fase temprana lo que lleva a la respuesta de fase tardía a las 4 a 12 horas después de la exposición al antígeno. Los mediadores inflamatorios, como los cysLTs, producidos por estas células inflamatorias producen edema de la mucosa nasal.

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se identificaron de manera reciente como células efectoras importantes de la respuesta inmune innata tipo Th2 en la inflamación de la vía aérea. Los alérgenos ambientales inducen la liberación rápida de IL-33, IL-25 y linfopoyetina del estroma tímico (LPET) de las células epiteliales de las vía aérea y en respuesta a estas citocinas, las ILC2 producen de manera rápida grandes cantidades de citocinas Th2 como IL-5, IL-9, IL-13 y factores de crecimiento como la amfiregulina, lo que produce eosinofilia de la vía aérea, producción de moco y reparación de tejidos. Las poblaciones de ILC2 se encuentran en varios tejidos, como el sistema respiratorio, la nariz y la piel, y existen correlaciones fuertes entre la prevalencia de las ILC2 y la gravedad de la enfermedad del asma, la rinosinusitis crónica con pólipos nasales y la dermatitis atópica. En el estudio anterior de los autores, la prevalencia de ILC2 aumentó de manera significativa en los pólipos nasales de pacientes con rinosinusitis crónica eosinofílica y se correlacionó de manera positiva con el número de eosinófilos infiltrantes en los pólipos nasales. Sin embargo, el papel de las ILC2 en la fisiopatología de la RA no se entiende bien.

Los mastocitos y diversas células inflamatorias liberan mediadores de lípidos como PGD₂ y cysLTs en las respuestas de fase temprana y tardía en la RA. De manera reciente, se reportó que las ILC2 expresaban un receptor PGD₂, un receptor quimioatrayente de células Th2 expresado por moléculas homólogas (CRTH2) y un receptor cysLT, CysLT1, en muestras de sangre periférica humana y que la PGD₂ y los cysLTs inducían la producción de citocinas Th2 a partir de las ILC2. En el presente estudio, los autores plantearon la hipótesis de que la producción de PGD₂ y cysLT en la mucosa nasal inducida por antígenos estimula las ILC2 en los tejidos para producir citocinas Th2, lo que inicia la inflamación alérgica, incluida la infiltración de eosinófilos en la RA. Se analizó la prevalencia de ILC2 en los tejidos del cornete nasal inferior (CNI) y se examinaron los mecanismos de activación de las ILC2.

2 | MÉTODOS

2.1 | Reactivos

Los discos de papel de alérgenos de ácaros (Allergen Disc®) se adquirieron de Torii Pharmaceutical (Tokio, Japón). La tinción de Wright-Giemsa fue de Muto Pure Chemical (Tokio, Japón). Los anticuerpos anti-CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56, CD123, TCRαβ, TCRγδ, CD45, CD127 y CRTH2 eran de BioLegend (San Diego, CA). El FcεR1α antihumano era de eBioscience (San Diego, CA). El anticuerpo anti-CysLT1 humano era de Novus Biologicals (Littleton, CO). PGD2, LTC4, LTD4, LTE4, el tromboxano carbocíclico A2 (cTXA2) y el factor activador de plaquetas (PAF, C-16) fueron de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). La IL-33, la IL-25 y la LPET eran de PeproTech (Rocky Hill, NJ). La histamina, la penicilina y la estreptomicina eran de Wako (Osaka, Japón). El ramatroban (BAY u 3405) era de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Otros productos químicos fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

2.2 | Sujetos de estudio

Un total de 18 pacientes con RA inducida por APD (7 hombres y 11 mujeres) y 13 controles (6 hombres y 7 mujeres) se reclutaron del Departamento de Otorrinolaringología del Hospital de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Ciencias Médicas de Shiga (número de aprobación de ética 28-106). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Los pacientes tenían antecedentes de RA perenne y la RA inducida por APD se diagnosticó mediante la prueba de provocación nasal (PPN), pruebas cutáneas y con niveles de IgE sérica específica (≥0.7 UA/mL) según los criterios de Bousquet et al. Se excluyeron pacientes fumadores, asmáticos y con rinosinusitis crónica. Los datos clínicos de los sujetos de estudio se enumeraron en la Tabla 1. Los criterios de inclusión y exclusión completos se enumeraron en la Tabla S1.

2.3 | Análisis histológico

Los tejidos de la mucosa del CNI de pacientes con RA inducida por APD se obtuvieron durante la cirugía de conchotomía del CNI para mejorar la hipertrofia del CNI resistente al tratamiento y los de los controles se obtuvieron durante la cirugía para tumores del seno maxilar. La cuantificación de eosinófilos en los tejidos del CNI se realizó por 2 de los autores de forma independiente con tinción con hematoxilina y eosina en 5 campos bajo la microscopía óptica (aumento de 400x).

2.4 | Recolección de líquido de lavado nasal después de la PPN

Antes de la PPN, se realizó una rinoscopia anterior para confirmar la ausencia de anomalías nasales. Después de que el sujeto se sonó la nariz en reposo, se realizó una PPN. Se colocó un disco de papel de control seco (disco control) en el extremo anterior del CNI izquierdo. Después de 10 minutos, la cavidad nasal izquierda se lavó con 5 ml de solución salina fisiológica y se recogió el líquido del fluido nasal (LFN) del mismo lado mientras los sujetos no respiraron ni deglutieron. Después de un intervalo de 5 minutos, se colocó un disco seco de papel de alérgenos de APD (disco que contiene 150 ng de Der 1) en el extremo anterior del CNI derecho durante 10 minutos; luego, se recolectó el LFN del mismo lado. Después de la PPN, los sujetos del estudio recibieron un antagonista del receptor H1 de la histamina para aliviar sus síntomas. El LFN se colocó de manera inmediata en hielo y se filtró a través de una malla de nylon de 70 μm para eliminar la mucina. El LFN filtrado se centrifugó durante 10 minutos a 4°C a 200 ƍ. La mitad de los sobrenadantes se almacenaron congelados a -80°C hasta los ensayos de IL-33, IL-25, LPET, CCL11, CCL26, IL-5 e IL-13. La otra mitad de los sobrenadantes para los ensayos de PGD₂ y cysLT se evaporaron a presión negativa y se resuspendieron en tampón ELISA para PGD₂ o agua ultrapura para cysLT al volumen original, para proporcionar una concentración aproximada de 3 veces según las instrucciones del fabricante (Cayman Chemical). El sedimento restante se resuspendió en solución salina y se contó el número de eosinófilos con la tinción de Wright-Giemsa. Las puntuaciones totales de síntomas nasales (PTSN) se evaluaron antes y después de la PPN en todos los sujetos del estudio. Las PTSN se muestran en la Tabla S2.

2.5 | Aislamiento de ILC2 de sangre periférica y tejidos CNI

Las ILC2 en sangre periférica se aislaron de controles o de los pacientes con RA inducida por APD como se describió con anterioridad. De manera breve, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se aislaron con Histopaque 1083. El linaje de células (CD3, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56, CD123, TCRαβ, TCRγδ, FceR1α)-negativas CD45⁺ CD127⁺ CRTH2⁺ se clasificó con FACSAria (BD Biosciences, San José, CA) y se cultivó (1000 células/pocillo) en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante 4 a 5 semanas en 1640 RPMI que contiene suero autólogo al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) a 37°C con IL-2 (50 ng/ml). La mitad del medio se actualizó cada 2 a 3 días. En todos los experimentos in vitro, las ILC2 se incubaron con IL-2 para inducir la proliferación de las ILC2, luego las ILC2 se estimularon con PGD₂, LTC₄, LTD₄, LTE₄, cTXA₂, PAF, IL-33, IL-25, LPET, neurocinina A, sustancia P o histamina, con o sin ramatroban o montelukast. Se obtuvo tejido de la mucosa de CNI de los hombres después de la cirugía y se rascaron con curetas estériles. Las células raspadas se digirieron durante 30-45 minutos a 37°C con Liberase TM (125 μg/ml) y DNasa I (200 μg/ml) (ambas de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Las suspensiones celulares se filtraron a través de una malla de nylon de 70 μm. Las células restantes se trataron con un amortiguador de lisis ACK (Walkersville, MD) para lisar los glóbulos rojos. Las suspensiones celulares se trataron con el reactivo de tinción de células muertas reparable Aqua LIVE/DEAD (Invitrogen, Carlsbad, CA) como un discriminador vivo/muerto y se usaron para identificar ILC2 con FACSAria. Las ILC2 obtenidas del tejido del CNI (178-462 células, media 311 células) se cultivaron de manera inmediata (100 células/pocillo) con IL-33 (10 ng/ml), PGD₂ (1 μmol) o LTD₄(50 nel) en presencia de IL-2 (50 ng/mL).

2.6 | Ensayos

Se utilizaron kits ELISA para determinar las concentraciones de IL-33, IL-25, LPET, CCL11, CCL26, IL-5 e IL-13 (R&D Systems, Minneapolis, MN), y las de PGD₂ y cysLT (Cayman Chemical) en sobrenadantes, de acuerdo con las instrucciones del fabricante..

2.7 | Análisis estadístico

Los datos se presentaron como media ± EEM (error estándar de la media) para el número de sujetos o experimentos como se indica. Los datos se presentaron con diferencias estadísticas dentro de los grupos determinados mediante la prueba de rango con signo de Wilcoxon y entre los grupos que utilizan la prueba U de Mann-Whitney. Los valores categóricos se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Los valores de P < .05 se consideraron significativos de manera estadística.

3 | RESULTADOS

3.1 | Prevalencia de ILC2 en tejidos del CNI

Las ILC2 se identificaron como células Linaje^‐ CD45⁺ CD127⁺ CRTH2⁺ en los tejidos del CNI (Figura 1A). Para examinar la capacidad de las ILC2 para producir citocinas, las ILC2 obtenidas se estimularon con IL-33 (10 ng/ml), PGD₂(1 μmol) o LTD₄ (50 nel) en presencia de IL-2 ( 50 ng/mL) y se midió la producción de IL-5 mediante ELISA. Las ILC2 derivadas del tejido del CNI produjeron una gran cantidad de IL-5 en respuesta a la IL-33 (Figura S1), PGD₂ o LTD₄(Figura S2) en presencia de la IL-2.

Luego se comparó la prevalencia de ILC2 en tejidos del CNI de pacientes masculinos con RA no asmáticos con los controles. La prevalencia de ILC2 en los tejidos del CNI aumentó de manera significativa en pacientes con RA inducida por APD (Figura 1B). El número de eosinófilos infiltrantes en los tejidos del CNI también aumentó de manera significativa en pacientes con RA inducida por APD y hubo una correlación positiva entre la prevalencia de las ILC2 y el número de eosinófilos infiltrantes (Figura 1C, D y Figura S3).

Los CysLTs son potentes activadores de las ILC2 y estas acciones dependen en gran medida del receptor CysLT1. Se confirmó la expresión de CysLT1 en la superficie de las ILC2 derivadas del tejido del CNI mediante citometría de flujo (Figura 1E). Las tasas de expresión de CysLT1 en las ILC2 derivadas del tejido del CNI fueron 28.1 y 32.3% en pacientes con RA y 5.3 y 15.6% en los controles, de manera respectiva.

3.2 | PPN con disco de APD

Para investigar qué tipos de mediadores se producen en las respuestas alérgicas de fase temprana, se utilizó la PPN con un disco de APD para medir mediadores inflamatorios en el LFN de pacientes con RA inducida por APD. No hubo diferencias en los volúmenes del LFN recuperado entre los controles y los pacientes con RA inducida por APD (Figura S4). Los pacientes tenían secreción, obstrucción, prurito nasal y/o estornudos a los 10 minutos después de la PPN y sus PTSN aumentaron de manera significativa en comparación con el disco de control (Figura 2A). Los controles experimentaron pocos síntomas incluso después de la PPN con el disco con APD. El número de eosinófilos en el LFN aumentó de manera significativa después de la PPN en pacientes con RA inducida por APD (Figura 2B).

Luego se determinaron las concentraciones de mediadores inflamatorios en LFN a los 10 minutos después de la PPN; los de PGD2 y cysLTs aumentaron de manera significativa en pacientes con RA inducida por APD (Figura 3A, B). Las citocinas derivadas del epitelio, IL-33, IL-25 y LPET, son mediadores importantes de la respuesta alérgica innata y son conocidos por activar ILC2. Sin embargo, las concentraciones de IL-33, IL-25 y LPET no aumentaron en el LFN después de la PPN en pacientes con RA inducida por APD (Figura 3C-E). Además, las concentraciones de quimiocinas asociadas a eosinófilos, CCL11/eotaxina 1 y CCL26/eotaxina 3 y las citocinas Th2, IL-5 e IL-13, no aumentaron en el LFN después de la PPN (Figura 3F-I).

3.3 | Efectos de la PGD2 y los cysLT en la liberación de IL-5 e IL-13 de ILC2

Para examinar los efectos de los mediadores alérgicos en la liberación de IL-5 e IL-13 de ILC2, las ILC2 se separaron de las CMSP en pacientes con RA inducida por APD (la estrategia de activación se muestra en la Figura S5). Las ILC2 (Linaje^- CD45⁺ CD127⁺ CRTH2⁺) y las poblaciones de células de control (es decir, Linaje^- CD45⁺ CD127^- CRTH2^- y Linaje^- CD45⁺ CD127⁺ CRTH2^-) se estimularon con IL-33 e IL-2, y las ILC2, pero no con las otras poblaciones celulares, produjeron una gran cantidad de IL-5 (Figura S6). Las ILC2 derivadas de las CMSP también expresaron CysLT1 (Figura S7), un receptor para cysLTs, como se muestra en las ILC2 derivadas del CNI. Las ILC2 obtenidas se incubaron con concentraciones más elevadas de cada mediador durante 24 horas y se midió la producción de IL-5.

Varios mediadores alérgicos, como la histamina, los mediadores de lípidos (PGD₂, cysLT, PAF y cTXA², un análogo estable de TXA₂), citocinas derivadas de células epiteliales (IL-33, IL-25 y LPET) y neuropéptidos (neurocinina A y sustancia P) se utilizaron para examinar sus efectos en las ILC2. La PGD₂ indujo de manera significativa la producción de IL-5 a partir de las ILC2 de forma dependiente de la dosis, para alcanzar un máximo a 1 μmol (Figura 4A). Los CysLTs, el LTC₄, el LTD₄ o el LTE₄ también indujeron de manera significativa la producción de IL-5 a partir de las ILC2 de forma dependiente de la dosis, para alcanzar un máximo de 50 nel (Figura 4B). La IL-33 o la IL-25 indujeron de manera significativa la producción de la IL-5 a partir de las ILC2 de forma dependiente de la dosis, mientras que la LPET no mostró ningún efecto (Figura 4D). La histamina, el cTXA₂, el PAF, la neurocinina A y la sustancia P no tuvieron efecto sobre la producción de la IL-5 (Figura 4C, E).

A continuación, para comparar la producción de la IL-5 a partir de las ILC2 en los controles y en los pacientes con RA inducida por APD, las ILC2 derivadas de las CMSP se incubaron de manera inmediata con PGD₂ (1 μmol) o LTD₄ (50 nel) en presencia de IL-2 (50 ng/mL) durante 7 días. Como se muestra en la Figura 4F, las producciones de IL-5 inducidas por PGD₂ y LTD₄ a partir de las ILC2 en pacientes con RA aumentaron de manera significativa en comparación con los controles. La PGD₂ estimuló de manera significativa la producción de la IL-5 a partir de las ILC2 en pacientes con RA en presencia de la IL-2, mientras que el efecto estimulante de la PGD₂ en la producción de la IL-5 a partir de las ILC2 no tuvo significancia estadística en los controles.

La producción de IL-13 a partir de las ILC2 también se indujo de manera significativa por la PGD₂ (1 μmol) o los cysLT (50 nel). Luego se examinaron los efectos del ramatroban, un antagonista dual del receptor CRTH2 y del receptor de tromboxano (TP) y el montelukast, un antagonista del receptor CysLT1, en la producción de IL-5 e IL-13 a partir de las ILC2 inducidas por la PGD₂ y los cysLT, de manera respectiva.

Las ILC2 se incubaron con PGD₂ (1 μmol), LTC₄ (50 nel), LTD₄ (50 nel) o LTE₄ (50 nel) y ramatroban o montelukast durante 12 horas y se midió la producción de IL-5 e IL-13. El ramatroban inhibió de manera significativa la producción de IL-5 e IL-13 inducida por la PGD₂ a partir de las ILC2 de forma dependiente de la dosis (Figura 5A, C). El montelukast inhibió de manera significativa la producción de IL-5 e IL-13 inducida por cysLTs de forma dependiente de la dosis (Figura 5B, D).

4 | DISCUSIÓN

En el presente estudio, se identificaron las ILC2 que se encuentran en tejidos del CNI de pacientes con RA y las ILC2 derivadas de tejidos del CNI produjeron una gran cantidad de IL-5 en respuesta a IL-33, PGD₂ o LTD₄ en presencia de la IL-2 . La prevalencia de las ILC2 en los tejidos del CNI aumentó de manera significativa en pacientes con RA y hubo una correlación positiva entre la prevalencia de las ILC2 y el número de eosinófilos infiltrantes en los tejidos nasales de pacientes con RA. Estos resultados sugieren que las ILC2 que residen en los tejidos desempeñan algún papel en la inflamación local eosinofílica en la RA. El número mayor de ILC2 se reportó en muestras de raspado nasal a las 6 horas después del reto con alérgeno en pacientes asmáticos con RA inducida por polen de pasto.

Las hormonas sexuales pueden afectar la prevalencia de las ILC2, y las ILC2 en la sangre de las pacientes con asma fueron más altas de manera significativa que las de los pacientes masculinos. Para excluir los efectos de la condición asmática y las hormonas sexuales, se examinó la prevalencia de las ILC2 en los tejidos del CNI de pacientes masculinos no asmáticos con RA inducida por APD.

En el estudio anterior, la prevalencia de las ILC2 en las CMSP se elevó de manera significativa en pacientes con RA y con niveles séricos más altos de IgE. Se reportó una mayor prevalencia de las ILC2 en las CMSP en pacientes con RA inducida por polen de pasto durante la temporada de polen y esto se inhibió por inmunoterapia subcutánea específica. El aumento de la prevalencia de ILC2 en CMSP también se indujo a las 4 horas después de la exposición nasal a alérgenos de gatos en pacientes con RA. Las ILC2 se reclutan de manera directa a la mucosa nasal a través de la circulación sanguínea periférica y las ILC2 que residen en los tejidos proliferan in situ durante la respuesta inflamatoria. Estos resultados sugieren que las ILC2 en la mucosa nasal pueden desempeñar un papel importante en la fisiopatología de la RA.

Varios mediadores están involucrados en el desarrollo de la inflamación alérgica. En el presente estudio, las concentraciones de PGD₂ y cys-LT aumentaron de manera significativa en el LFN a los 10 minutos después de la PPN con un disco de APD en pacientes con RA inducida por APD. Estos resultados son consistentes con informes anteriores que estudian LFN de pacientes con RA inducida por la ambrosía después del reto con alérgenos nasales. La PGD₂ y los cysLT se producen principalmente a partir de mastocitos y basófilos por medio de la respuesta alérgica tipo I mediada por IgE y las ILC2 expresan de manera constitutiva CRTH2, un receptor PGD₂.

Los autores confirmaron la expresión de un receptor cysLTs, CysLT1, en la superficie celular de las ILC2 derivadas de los tejido del CNI y de las CMSP por citometría de flujo. Se reportó que la expresión de CysLT1 de las ILC2 derivadas de las CMSP se incrementó de manera significativa en sujetos atópicos tanto a nivel de proteína como de ARNm. En el presente estudio, la expresión de los CysLT1 en las ILC2 derivadas del tejido del CNI también aumentó en pacientes con RA en comparación con la de los controles, aunque el tamaño de la muestra era demasiado pequeño para establecer una diferencia estadística. La PGD₂ y los cysLT son potentes activadores de las ILC2 y se demostró que el aumento de las ILC2 se recluta de manera directa y se demostró que PGD2 y cysLT (LTC4 LTD4 y LTE4) estimularon de manera significativa la producción de IL-5 e IL-13 a partir de ILC2 derivadas de CMSP cultivadas durante 12 horas. De manera interesante, las producciones de IL-5 inducidas por PGD₂ y LTD₄ a partir de las ILC2 en pacientes con RA aumentaron de manera significativa en comparación con las de los controles, lo que puede reflejar la expresión incrementada de CRTH2 y CysLT1 en las ILC2 en pacientes con RA. Además, la PGD₂ o el LTD₄ estimularon la producción de IL-5 a partir de las ILC2 derivadas del tejido del CNI durante 7 días. Estos resultados sugieren que el reto con alérgenos induce la liberación rápida de PGD₂ y cysLT en la mucosa nasal humana y estos mediadores de lípidos pueden estimular las ILC2 residentes en los tejidos para producir citocinas Th2, lo que lleva al desarrollo de inflamación alérgica en la RA. Sin embargo, la limitación es no poder comparar las respuestas de las ILC2 derivadas de las CMSP y las de los tejidos del CNI ya que pueden existir diferencias funcionales entre estas ILC2.

La IL-33, la IL-25 y la LPET son mediadores clave de la inflamación alérgica innata al inducir la producción de citocinas Th2 a partir de las ILC2. Se reportó que la expresión de ARNm de la IL-33, la IL-25 y la LPET aumentó de manera significativa en la mucosa nasal de pacientes con RA y las concentraciones de la IL-25 y la LPET aumentaron en el LFN de pacientes con RA, sin embargo, en el estudio actual, las concentraciones de la IL-33, la IL-25 y la LPET no aumentaron en el LFN a los 10 minutos después de la PPN, aunque la IL-33 y la IL-25 indujeron la producción de la IL-5 a partir de las ILC2. Un estudio anterior mostró que la liberación de la IL-33 se indujo en la secreción nasal de pacientes con RA estacional de 10 minutos a 5 horas después de la exposición al alérgeno del polen. Para evaluar el papel de estas citocinas derivadas del epitelio en la activación de las ILC2 en la fisiopatología de la RA, se necesitarán más experimentos cinéticos.

También se examinaron las concentraciones de otros mediadores en el LFN a los 10 minutos después de la PPN; los de eotaxina 1, eotaxina 3, IL-5 e IL-13 no se incrementaron. Las concentraciones de la IL-5 y la IL-13 en el LFN se elevaron varias horas después del reto con alérgenos nasales en pacientes con RA. Las células Th2 y las ILC2 pueden contribuir a la producción de la IL-5 y la IL-13 en la inflamación alérgica de las vías respiratorias. De manera particular, en ratones asmáticos inducidos por ovoalbúmina, la contribución de las ILC2 a la población total de células intracelulares positivas para la IL-5 y la IL-13 en el pulmón estaba en el mismo rango que el encontrado para las células TH2. Estos resultados indican que al menos alguna parte de las respuestas de fase tardía en pacientes con RA pueden ser causadas por las IL-5 e IL-13 inducidas por la ILC2.

La PGD₂ se une a uno de los tres receptores específicos: DP1, CRTH2 y TP. DP1 funciona de manera principal como una vía de transmisión de señales antiinflamatorias, mientras que la activación del CRTH2 media la migración y activación celular. Se reportó que la PGD₂ puede desempeñar un papel importante en la infiltración de eosinófilos en las respuestas de fase temprana por medio del CRTH2 expresado en los eosinófilos con un modelo múrido de RA. TP también se conoce como un receptor de alta afinidad para TXA2. En el presente estudio, la PGD₂, pero no el cTXA₂, estimuló la producción de IL-5 de las ILC2 y el ramatroban, un antagonista dual para CRTH2 y TP, inhibió por completo la producción inducida por la PGD₂, de IL-5 e IL-13 de las ILC2, lo que sugiere que la PGD₂ activa las ILC2 por medio de un receptor CRTH2.

Entre los cysLTs, después de la liberación en el espacio extracelular, el LTC₄ se convierte en el LTD₄ y luego en el producto terminal el LTE₄, el cysLT más abundante en fluidos biológicos. A pesar de que tiene poca afinidad de unión al receptor, CysLT1, todavía tiene una actividad agonista potente. Los CysLTs tienen un papel importante en la acumulación y activación de los eosinófilos por medio de CysLT1. Las ILC2 de sangre periférica también se reportó que expresan CysLT1 y el presente estudio reveló la expresión de CysLT1 en las ILC2 derivadas del tejido del CNI. El LTC₄, el LTD₄ y el LTE₄ estimularon la producción de IL-5 e IL-13 a partir de las ILC2 y esto se inhibió de manera completa por el antagonista de los CysLT1, el montelukast. Luego se examinaron los efectos de otros mediadores alérgicos encontrados en las respuestas de fase temprana, es decir, histamina, PAF, sustancia P y neurocinina. Sin embargo, estos mediadores no indujeron la producción de IL-5 a partir de las ILC2 derivadas de las CMSP.

En conclusión, se encontraron mayores ILC2 residentes en los tejidos en la mucosa nasal de pacientes con RA inducida por APD. Hubo una correlación positiva entre la prevalencia de las ILC2 y el número de eosinófilos infiltrantes en la mucosa nasal. La PGD₂ y los cysLTs son mediadores importantes para las respuestas alérgicas de fase temprana y sus concentraciones aumentaron de manera significativa en el LFN de pacientes con RA a los 10 minutos después de la PPN.

Los ILC2 residentes en el tejido de la mucosa nasal expresaron sus receptores específicos, CRTH2 y CysLT1, y PGD2 y cysLTs indujeron de manera significativa la producción de IL-5 e IL-13 de ILC2 derivados de CMSP a través de estos receptores. Ramatroban y montelukast inhibieron por completo la producción inducida por PGD2 y por cysLTs de IL-5 e IL-13 de ILC2, manera respectiva y su dosis efectiva (1 μmol de ramatroban, 0.1 a 1 μmol de montelukast) fueron iguales a las concentraciones sanguíneas de estos fármacos después de la administración oral en pacientes con RA.

Estos resultados indican que los ejes PGD₂-CRTH2 y cysLTs-CysLT1 pueden estimular las ILC2 residentes en los tejidos para producir citocinas Th2, IL-5 e IL-13, lo que lleva al desarrollo de inflamación alérgica en la RA y que la efectividad clínica del ramatroban y el montelukast puede estar mediada en parte por la inhibición de la liberación de citocinas Th2 de las ILC2.

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