Reactividad cruzada por ingredientes botánicos utilizados en suplementos dietéticos y especias con la prueba de detección de alérgenos alimentarios xMAP multiplex (xMAP FADA)

Introducción

Las alergias alimentarias son un problema internacional que afecta a nivel mundial a las personas con tasas de prevalencia que varían hasta en 10% de acuerdo con la dieta, las prácticas culturales y la disposición genética. Las alergias alimentarias causan un tremendo estrés en el individuo alérgico, sus familiares y amigos, y la sociedad, y causan aproximadamente 200.000 visitas a la sala de emergencia en los EE. UU. cada año. Se estableció la Ley de Etiquetado de Alérgenos Alimentarios y Protección al Consumidor de 2004 (FALCPA) para abordar de forma parcial este problema.

La FALCPA requiere el etiquetado de los productos alimentarios que contengan cualquiera de los ocho principales grupos alergénicos de comida; los mariscos y crustáceos, el huevo, el pescado, la leche, el cacahuate, la soya, los frutos secos y el trigo. Además, se emitió la regulación Libre de Gluten de 2013 para definir el uso del término voluntario libre de gluten como indicativo de la presencia de <20 ppm de gluten intacto. La aplicación de FALCPA y la Regulación Libre de Gluten de 2013 dependen en parte de la disponibilidad de métodos analíticos capaces de medir los alérgenos especificados y el gluten en matrices diferentes de forma extensa. Los kits comerciales de prueba de ELISA son en la actualidad los principales métodos utilizados para analizar muestras de alimentos sospechosos de contener alérgenos alimentarios no declarados o de violar la Regulación Libre de Gluten de 2013. A pesar de ser sólidas, sensibles y fáciles de realizar, las pruebas de ELISA también tienen limitaciones graves que podrían tener resultados engañosos. Una debilidad mayor de la tecnología ELISA de analito único que se utiliza en la actualidad es una incapacidad para distinguir entre los antígenos diana y las proteínas homólogas de reacción cruzada. Como resultado, las pruebas de ELISA específicas para analitos son inapropiadas para la detección precisa y la cuantificación de alérgenos alimentarios desconocidos o múltiples alérgenos alimentarios.

Una solución potencial a los problemas encontrados con la tecnología clásica de ELISA implica el uso de los métodos multiplexados. Numerosos métodos se desarrollaron para detectar alérgenos alimentarios de forma confiable. Sin embargo, cualquiera que sea el método empleado por la FDA para la aplicación de regulaciones debe estar disponible para que otros lo puedan usar. Ya que los anticuerpos son únicos, esto significa que los métodos basados en anticuerpos utilizados para el análisis regulador deben estar disponibles de manera comercial. Para cumplir con esta restricción, la FDA trabajó con Radix BioSolutions para desarrollar una prueba comercial de ensayo multiplex para alérgenos alimentarios con tecnología que perfile múltiples analitos (xMAP). Fueron fundamentales para esta tarea las generosas contribuciones del Instituto Morinaga de Ciencias Biológicas, Inc. (MIoBS), el Grupo de Laboratorios y Consultores IEH y Tecnologías de Elución. Los métodos basados en xMAP se volvieron populares para la detección de agentes infecciosos y biomarcadores en parte debido a su precisión alta, sensibilidad y solidez. Aunque la tecnología xMAP se utilizó por otros grupos para detectar alérgenos alimentarios, estos ensayos emplearon un diseño competitivo o detectaron amplicones derivados de PCR. La prueba de detección de alérgenos alimentarios xMAP® (xMAP FADA) desarrollada por Radix BioSolutions emplea una configuración tipo sándwich basada en anticuerpos establecidos, dos protocolos complementarios de extracción y un nivel alto de redundancia para generar múltiples puntos finales confirmatorios incorporados. Los dos protocolos de extracción utilizados por el xMAP FADA, un protocolo de detergente amortiguado (PBST o UD-Buffer) y un protocolo de desnaturalización reducida (SDS/β-mercaptoetanol), imitan dos protocolos populares de extracción empleados por los kits de prueba de ELISA comerciales. La presencia del antígeno diana se indica por la formación del complejo de perlas de captura anticuerpo-antígeno-anticuerpo detector-biotina-estreptavidina-ficoeritrina. El xMAP FADA es capaz de detectar de forma simultánea 14 alérgenos de alimentos más el gluten, lo que reduce el tiempo, la mano de obra y los costos. Los anticuerpos redundantes que se dirigen a diferentes epítopos en el mismo alimento alergénico con sensibilidad suficiente para medir la reactividad cruzada y realizar perfiles de multianticuerpos proporcionan puntos finales confirmatorios incorporados como se aplicó de forma reciente para el análisis de comino, frutos secos y leguminosas, y en la detección de cacahuate no declarado en el polvo de ajo.

Los perfiles multianticuerpo, una forma de huella dactilar antigénica, se usaron de manera reciente para distinguir entre múltiples frutos secos y leguminosas que no son dianas de anticuerpos específicos en el xMAP FADA. El enfoque también fue de uso exitoso para analizar muestras reguladoras sospechosas de contener pecana, a pesar de la falta de anticuerpos específicos para pecana. Esto, junto con la capacidad de agregar conjuntos nuevos conjugados de perlas de anticuerpos o elegir de manera selectiva los conjuntos de perlas incluidos en un cóctel, proporciona capacidad de expansión y la habilidad de personalizar las pruebas para satisfacer necesidades analíticas no anticipadas.

El uso creciente de productos botánicos, el comercio mundial de hierbas de nuevos cultivadores y los productos vegetales nuevos hacen posible la aparición de reacciones alérgicas debidas a reactividad cruzada (alergenicidad), la comezcla agrícola y el contacto cruzado inadvertido una amenaza grave para el consumidor alérgico. Esto se vuelve complejo en especial cuando se trata de productos herbales premolidos manufacturados en instalaciones que utilizan equipos compartidos. Las tecnologías analíticas de uso corriente (por ejemplo, ELISA) no pueden abordar estos problemas sin un aumento sustancial de recursos (por ejemplo, con el uso de múltiples kits de prueba, mano de obra, finanzas, tiempo, material de muestra). El problema se complica aún más por los usos múltiples de los productos vegetales, por las rutas potenciales de exposición (por ejemplo, oral y dérmica) y por la dosificación. Por ejemplo, el ajo, la cúrcuma, y la canela se utilizan como especias y como suplementos dietéticos. El xMAP FADA provee un punto de inicio para abordar estos problemas. Los múltiples puntos finales posibles hacen que sea probable detectar, identificar y caracterizar a los alérgenos alimentarios en los productos botánicos utilizados en suplementos dietéticos y especias y distinguir entre cualquier elemento homólogo de reacción cruzada. Se examinaron cuarenta y cinco suplementos dietéticos diferentes, especias y diferentes productos botánicos vendidos en los Estados Unidos con el xMAP FADA para verificar la reactividad cruzada, lo cual es un primer paso necesario antes de aplicar el xMAP para determinar la presencia de alérgenos alimentarios no declarados en estos productos.

Material y métodos

Reactivos Se compró solución salina amortiguada con fosfato (PBS, cat# P5368) y Tween 20 (cat # P9416) de Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO). La leche descremada en polvo BD Difco y el sulfato dodecil de sodio (SDS, cat# 28312) se adquirieron de Fisher Scientific (Waltham, MA). Todos los demás reactivos fueron del grado técnico más alto disponible.

Productos botánicos Los productos botánicos se compraron de vendedores en línea y de proveedores locales. Se adquirieron controles y muestras por duplicado de múltiples proveedores cuando fue posible para confirmar la antigenicidad de dichos productos comerciales. Se adquirió Hoodia gordonii, Rauvolfia serpentina y nuez de betel (areca) del Centro Nacional de Investigación de Productos Naturales (NCNPR) de la Universidad de Mississippi (Universidad, MS). Los arándanos se compraron como bayas enteras crudas frescas y bayas enteras liofilizadas. Los arándanos azules se compraron como bayas enteras liofilizadas. El cohosh negro (Cimicifuga racemosa), la canela, las bayas de palma enana americana o saw palmetto (Serenoa repens) y las raíces de eleutero (Eleutherococcus senticosus) se compraron en trozos cortados. Los productos examinados no se eligieron para representar un estudio de peritaje sistemático ni de popularidad comercial o por tener un determinado interés regulatorio, sino más bien por ser representativos como productos que estaban disponibles con facilidad y para proporcionar una exploración inicial de productos botánicos comerciales locales que estaban disponibles.

Prueba de detección de alérgenos alimentarios xMAP La prueba de detección de alérgenos alimentarios xMAP (xMAP FADA) (Radix BioSolutions, Georgetown, TX) se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras de detergente amortiguadas se extrajeron de acuerdo con el protocolo UD Buffer que implicaba mezclar 1 g de muestra en 40 ml de amortiguador UD (105 mM de fosfato de sodio/75 mM de NaCl al 2.5% de leche desnatada Difco en polvo al 0.05% Tween 20) por 2 horas con agitación constante en la oscuridad, centrifugado y 50 μL del sobrenadante analizado ya sea así como estaba o luego de una dilución en una serie de diez veces con amortiguador UD. La única excepción a esto fue con los arándanos crudos que se extrajeron al mezclar 7.89 g en 33.1 mL de amortiguador UD para compensar el 87.3% de contenido de agua. La extracción reducida-desnaturalizada supuso la suspensión de 1 g de muestra en 10 ml de PBST al mezclar la muestra 1:1 con 10 ml de SDS al 0.5% y con β-mercaptoetanol al 2% durante 30 min a 60°C. Después de una centrifugación, el sobrenadante se diluyó 100 veces con PBST para la reducción consecuente del contenido de SDS y β-mercaptoetanol.

Después de la extracción, se hizo una mezcla 1:1 de 50 μL de las muestras extraídas (con los estándares de calibración) con el coctel apropiado de perlas (para)magnéticas que contenía perlas codificadas por color conjugadas con diferentes anticuerpos de captura (Acc) durante 30 minutos a 37°C. El cóctel de perlas para el análisis del extracto  de muestras amortiguador-detergente contenían 25 conjuntos de perlas de alérgenos alimentarios [almendra (conjunto de perlas-12, 13), nuez del Brasil (14, 15), anacardo (18, 19), coco (20, 21), crustáceo (22), gluten (27, 28), avellana (29, 30), macadamia (33, 34), cacahuate (37, 38), piñones (39, 42), pistacho (43, 44), soya (45, 46), nuez (47, 48)], 4 conjuntos de perlas del panel de control AssayChex® Process (75, 76, 77, 78; Radix BioSolutions, Georgetown, TX) para detectar posibles fallos operacionales, y para este trabajo se colocaron 4 conjuntos de perlas experimentales adicionales (datos no mostrados) para la detección de huevo (25, 26) y leche (35, 36). El cóctel de perlas utilizado para el análisis de los extractos de muestra reducidos-desnaturalizados consistía en cinco juegos de perlas de alérgenos alimentarios [huevo (65), gluten (73), leche (66, 67) y cacahuate (72)] más los cuatro paneles de control de proceso de los conjuntos de perlas AssayChex®.

La presencia del antígeno diana (Ag) en el extracto de la muestra se indicó por la unión del anticuerpo detector biotinilado (Abd-biotina) con el complejo perla-Acc-Ag durante la segunda etapa de incubación (30 min a 37 °C con agitación). Luego se agrega estreptavidina ficoeritrina (SAPE) para visualizar el complejo de perla-Acc-Ag-Acd-biotina (15 min a 37°C con agitación). Tanto a la mitad y después del paso final de incubación, las muestras se lavaron con PBST.

Los estándares de calibración se suministraron como una mezcla 200X de los 15 analitos, que se diluyeron en un amortiguador UD para el análisis de detergente-amortiguador o que se sometieron al mismo procedimiento de extracción y dilución usado en las muestras en el análisis desnaturalizado-reducido. El uso de estándares de calibración que son una mezcla de múltiples analitos puede generar curvas de calibración con distorsiones ligeras, de acuerdo con la magnitud de cualquier reactividad cruzada. Tales mezclas son muy adecuadas para aquellos datos que se normalizan entre múltiples experimentos o que se generan con reactivos de diferentes lotes. Sin embargo, para una cuantificación detallada, la magnitud de cualquier distorsión debe determinarse como se hizo de manera previa y confirmarse por la inclusión de controles de comparación directos (DCC) que consisten en muestras libres de analitos enriquecidas con una cantidad predefinida de un analito individual, que se encuentra en general en un nivel umbral diana o crítico (por ejemplo, gluten a 20 ppm). Aunque el rango dinámico de análisis de alérgenos alimentarios de xMAP FADA se asigna a unos valores de LoQ comparables al estándar más bajo de calibración distinto a cero, la mayoría muestra valores reproducibles de LoD menores de manera considerable que aquellos indicados por el historial de las desviaciones estándar medidas de manera empírica.

Todas las muestras de alimentos se extrajeron por triplicado y la mediana de las intensidades de fluorescencia (MFI) se midió de las perlas de lavado suspendidas en 100 μL de PBST con un Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA) y los datos se sometieron a un análisis estadístico como se describió de forma previa. Esto de forma típica implicó restar el promedio histórico de MFI (S0) para cada conjunto de perlas de las respuestas MFI promedio generadas por las muestras por triplicado.

Variabilidad interlote y experimental Los conjuntos de perlas y reactivos se suministraron en viales que contienen el equivalente de kits de prueba múltiples, de forma típica cinco. Esto reduce la variabilidad entre experimentos, siempre que se tome la precaución de no dañar de forma inadvertida la porción no utilizada de los reactivos (por ejemplo, mediante un calentamiento innecesario). Sin embargo, ya que la preparación de los reactivos xMAP FADA implica múltiples reacciones de purificación y conjugación de anticuerpos, la variabilidad entre lotes puede ser mayor que la típica para kits de prueba de ELISA. La variabilidad entre diferentes lotes o experimentos se puede corregir al normalizar los resultados a los estándares analizados junto con las muestras. Esto se logra de rutina con los estándares de calibración suministrados con el xMAP FADA o mediante la inclusión de otros materiales de referencia en el análisis (por ejemplo, DCC). Se debe tener cuidado para asegurar que los materiales de referencia coincidan con las muestras o que cualquier variación asociada no exceda los límites aceptables.

Material electrónico suplementario El material electrónico suplementario (ESM) tabula la información de la etiqueta de los botánicos que se suministraron con la información de que contienen múltiples ingredientes (ESM Tabla S1), las respuestas de las MFI generadas por los estándares de calibración de los análisis de detergentes amortiguadores (ESM Tabla S2a), las respuestas de las MFI generadas por los estándares de calibración de los análisis de desnaturalización reducción (ESM Tabla S2b), y las concentraciones de los analitos en los estándares de calibración (ESM Tabla S3). Los estándares de calibración de los kits de prueba xMAP FADA se ejecutaron en días separados con 16 kits de prueba diferentes de 2 series de producción designados 1A-5A y 6B – 16B. Los lotes A y B presentan mayores diferencias que aquellas producidas por la línea de producción utilizada para producir los reactivos (desde cero). El segundo lote (B) también empleó un nuevo material de referencia de cacahuate a concentraciones de una décima parte del lote A (ESMTable S3). Como se esperaba, los resultados de las MFI agrupados en conjunto por lote (excepto 5A) con promedios entre las MFI generadas por anticuerpos complementarios (generadas contra el mismo alérgeno alimentario) mostraron la disminución esperada en la varianza. La excepción, 5A mostró promedios y MFI diferentes que los resultados generados en experimentos con reactivos del mismo lote (por ejemplo, 1A, 2A, 3A, 4A) o del lote B. Esta variación puede reflejar los problemas de instrumentación que necesitaron desarrollar una segunda verificación antes de usar el Bio-Plex 200 y/o posible daño a los reactivos como resultado de las múltiples veces que se utilizaron las soluciones de stock para preparar conjuntos de perlas y cocteles de detección.

Resultados y discusión

La tabla 1 enumera las muestras botánicas examinadas. Los materiales de control de referencia se designan con una “C”, con una “B” para identificar los productos botánicos comerciales. Aunque la mayoría de los productos contenían de manera primaria el nombre del ingrediente, era común que algunos tuvieran como contenido agentes de encapsulación, procesamiento, antiaglomerado y flujo como se detalla en ESM de la Tabla S1 de. La mayoría de los botánicos se compraron como especias y no tenían ningún otro ingrediente que se citara en la etiqueta.

La MFI promedio generada por los diversos productos botánicos con el xMAP FADA se enumera en las Tablas 2, 3, 4 y 5. Las tablas 2 y 3 muestran los análisis de detergentes amortiguadores de las muestras derivadas de frutos/semillas y derivadas de otras partes de las plantas (por ejemplo, la flor, hoja, raíz y el tallo), de manera respectiva. Las Tablas 4 y 5 muestran los análisis de los protocolos de reducción/desnaturalización similares a las Tablas 2 y 3. Las MFI por debajo del estándar de calibración más bajo (S1, que se corrieron a lo largo de las muestras) se designan en las tablas con un “<”; las MFI que se encontraban dentro de las tres desviaciones estándar del histórico (S0) se designan como “<<”. Los extractos de detergente amortiguador que generaron respuestas de MFI por arriba del estándar de calibración más alto (S7) se diluyeron y la MFI de la muestra diluida se enumeró junto con la muestra sin diluir con resaltadores amarillo, naranja o rojo para indicar si la dilución fue de 10, 100 o de 1000 veces, de manera respectiva.

Junto a los valores de MFI están los promedios para los pares de anticuerpos. Si la MFI fue secundaria a la presencia del analito diana, el promedio entre los anticuerpos pareados sería el mismo que el promedio generado por el material de referencia (estándar de calibración) a la misma concentración (ver ESM de Tablas S2a y S2b), siempre que las IMF estuvieran dentro del rango dinámico como estaba definido por los estándares de calibración.

Relación entre IMF y reactividad cruzada La Figura 1 muestra la relación entre la MFI y la reactividad cruzada sobre una base de masa total para muestras de 1 g extraídas con el protocolo de amortiguador UD y al diluir 100 veces luego de una centrifugación (para generar una respuesta dentro del rango dinámico). Los datos utilizados para generar las curvas de relación se basan en el promedio de MFI generada por los reactivos del lote A en los experimentos 1A-4A (Fig. 1a-c) o los reactivos del lote B en los experimentos 6B-11B (Fig. 1d-f) como se tabula en ESM de la Tabla S2a. Se presenta un juego de perlas para cada analito, excepto para el gluten que incluye los juegos de perlas 27 y 28. Se calculó el porcentaje de reactividad cruzada en base en la concentración de proteínas en los estándares de calibración estándares (ESM Tabla S3) convertidos a la cantidad de total analito con el contenido de proteínas como se publica en el la Base de Datos Nacional de Nutrientes y en los certificados de análisis para los materiales de referencia comerciales utilizados. Para las muestras que se diluyeron 1000 veces, el porcentaje de reactividad cruzada interpolado se debe multiplicar por 10. Del mismo modo, las muestras analizadas sin diluciones o después de una dilución de diez veces, se requiere que la reactividad cruzada interpolada se divida por 100 o 10, de forma respectiva. Por ejemplo, si se extrajo una muestra con el protocolo de amortiguador UD diluido 100 veces después de la centrifugación que generara una IMF de 2000 con anacardo-18, cuando se analiza con un kit de ensayo del lote A, la MFI corresponde a una reactividad cruzada de 0.006% (Fig. 1c). Si la muestra se diluyó sólo diez veces, entonces la reactividad cruzada sería 0.0006%, es decir con el valor interpolado a partir de la gráfica dividida por diez. Si la muestra diluida diez veces también genera una MFI con anacardo-19 que produjera una proporción de anacardo-18/anacardo-19 comparable a la proporción generada por el material de referencia comparable, el resultado interpolado sería de 0.0006% que indicaría la presencia probable de 6 μg de anacardo en la muestra de 1 g (0.0006%, 6 × 10^-6, o 6 ppm). Debería ser necesario para ser más preciso de lo posible al usar los valores medios de MFI derivados de análisis múltiples, los conjuntos de datos individuales para cada experimento (ESM en las tablas S2a y S2b) se pueden trazar para generar figuras específicas al experimento. Por último, los factores de conversión de contenido de proteína se basan en el contenido total de proteínas (nitrógeno), según lo determinado por el análisis de Dumas o Kjeldahl, mientras que los estándares de calibración se basan en proteínas solubles y análisis de BCA. Como tal, el porcentaje calculado por masa (y la reactividad cruzada derivada) es un límite inferior.

Visión general El uso combinado de múltiples puntos finales secundarios, de los peores escenarios de caso y las pruebas de razonabilidad hacen que sea posible estimar de manera indirecta las concentraciones de alérgenos. La magnitud de las respuestas de las MFI medidas para un subconjunto de suplementos dietéticos y especias estuvieron por encima del promedio histórico de manera significativa. Aunque definitivas, las MFI fueron en su mayoría consistentes con cantidades minúsculas de alérgeno o con niveles muy bajos de reactividad cruzada con sólo pocas excepciones.

Las muestras de frutos y semillas mostraron una mayor prevalencia de reactividad cruzada en xMAP FADA que los extractos preparado a partir de otras partes de la planta (por ejemplo, flor, hoja, raíz o tallo). Esto refleja de manera probable múltiples factores incluyendo que 22 de los anticuerpos de detección del protocolo detergente-amortiguador involucran anticuerpos generados contra proteínas derivadas de las nueces y frijoles. Además, las proteínas alergénicas no se distribuyen de manera uniforme en todas las clases de proteínas y muestran una mayor presencia en las plantas y las proteínas de almacenamiento. Además de las diferencias entre las partes de una planta, también se observó una agrupación en función de la filogenia. Un ejemplo de esto fue la reactividad cruzada entre miembros de la familia de las Arecaceae (por ejemplo, la nuez de betel, la palma enana y el acai) con los grupos de perlas de anticuerpos de coco. Aunque el acai, la nuez de betel y la palma enana mostraron reactividad cruzada con el coco-20, cada una de ellas mostró perfiles únicos de reactividad cruzada con los otros anticuerpos.

Acai El acai, al igual que las nueces de betel, la palma enana americana y el coco, es miembro de la familia Arecaceae. Dos muestras de acai, una pulverizada y congelada (i) y la otra en polvo (ii), se examinaron con el xMAP Fada. Sólo el coco-20 generó una respuesta reproducible (MFI) que fue característica de una reactividad cruzada de 0.0001% (995) y 0.00033% (4714), de manera respectiva. Una respuesta débil (MFI 50) se observó con coco-21 por Acai-ii (Coco-20/Coco-21 cociente de 94) que fue inconsistente y sólo diferente de los promedios generados por el coco, la nuez de betel y el saw palmeto.

Nuez de betel La nuez de betel (nuez de areca) es popular en muchos países asiáticos y a menudo se mastica (por ejemplo, la betel quid) a pesar de vincularse con diversos efectos adversos para la salud. La nuez de betel en el xMAP FADA mostró una reactividad cruzada excepcional con coco-20 y -21, con el nogal-47 y -48, la macadamia-33 y la avellana-29. La reactividad cruzada de las muestras de nuez de betel con los anticuerpos de coco requirió una dilución de más de 1000 veces después de la centrifugación para generar respuestas MFI dentro del rango dinámico del ensayo. Los promedios de coco-20/coco-21 generados por las dos muestras de nuez de betel analizadas con reactivos de dos lotes diferentes (1A y 7B) fueron 18 y 15. En contraste, el estándar de calibración (S4) que generó una MFI comparable con coco-20, se realizó junto a las dos muestras de nuez de betel que mostraron promedios de 49 y 55. Esta diferencia considerable en la antigenicidad hacia los dos conjuntos de perlas por las muestras de las nueces de betel y los estándares de calibración debe ser secundaria ya sea a las extensas modificaciones de uno o varios epítopos de coco no declarado presente en las muestras como puede ocurrir en el procesamiento de los alimentos o por la presencia de proteínas homólogas que generen reactividad cruzada. Dado que las nueces de betel no se procesaron, las diferencias de promedio de los conjuntos de perlas descartan la presencia de coco e indican la presencia de homólogos de reactividad cruzada al 0.4% (interpolados de la Fig. 1c, f y corregidos por dilución). Esto no es sorprendente ya que las nueces de betel y los cocos son miembros de la familia Arecaceae.

La nuez de betel también mostró reactividad cruzada con los anticuerpos de la nuez (familia Juglandaceae) y macadamia (familia Proteaceae) que no cuadran con ningún alérgeno presente. En específico, la nuez de Betel-i y la nuez de Betel-ii mostraron promedios con nogal-47/nogal-48 de 0.8 y 1.1 mientras que los estándares comparables de calibración fueron de 4.5 y 3.7, de manera respectiva. Una MFI de 15,000 con macadamia-33 y una ausencia de MFI medible con macadamia-34 es inconsistente con la proporción macadamia-33/macadamia-34 con 5 estándares comparables establecidos de calibración que resultaron en una MFI medible de 3000 con macadamia-34. La conclusión de que la nuez de betel tiene una reactividad cruzada con los anticuerpos de nuez-47 y macadamia-33 (0.001 y 0.12% para nuez de betel-i; 0.0008 y 0.01% para nuez de betel-ii; Tabla 2 y Fig. 1) es consistente con los estudios de IgE de coco. En específico, aunque los estudios clínicos no observaron una correlación entre las alergias al coco y los frutos secos, la IgE de individuos alérgicos al coco reconoce de una manera intensa a la nuez y los patrones de cosensibilización de IgE específica del suero (sIgE) indicaron un fuerte reconocimiento por las IgEs del coco a la macadamia.

Fue inesperada la reactividad cruzada entre la nuez de betel-i y nuez de betel-ii con la avellana-29 al 0.0015% (MFI 5700) y al 0.003% (MFI 3600), de manera respectiva, sin reactividad cruzada con la avellana-30 (MFI <130). Saber si las diferencias cuantitativas entre la nuez de betel-i (que es un control de semilla pura) y la nuez de betel-ii (que es una mezcla premolida), representan diferencias relacionadas con la producción o diferencias basadas en las plantas, requiere de investigaciones futuras.

Palma enana (Saw palmetto) Un producto botánico que mostró una reactividad cruzada excepcional fue la palma enana. Esta planta al igual que la nuez de betel y el acai, es un miembro de la familia de palmeras Arecaceae y podría distinguirse de los otros miembros por su reactividad cruzada con los anticuerpos del anacardo. Tres muestras de palma enana se examinaron y las tres generaron respuestas MFI similares a pesar a que la muestra de palma enana-i se derivaba de un control de baya. En específico, las tres muestras de palma enana generaron respuestas con coco 20, coco 21 (proporciones 11, 9, 5; promedio de 8.3), anacardo 18, anacardo 19 (relaciones 0.9, 1.0, 1.1; promedio de 1.0), nogal-47, nogal 48 (relaciones 0.8, 2.2, 0.4; promedio de  1.1) que rindieron proporciones inconsistentes con los estándares de calibración que oscilaron entre 42-56, 1.8–3.1 y 3.6–4.6 para los tres alérgenos, de manera respectiva. Sólo los grupos de perlas de la avellana-29 y la avellana-30 generaron proporciones (3.9, 5.8, 3.8; promedio 4.5) similares a las relaciones observadas con el estándar de calibración comparable (S6 proporción de 4.4), lo cual, si se debe a la presencia de la avellana, indicaría 6 ppm de avellana (0.0006%). La palma enana también mostró de manera consistente MFI de 2200 con la nuez de Brasil-14 y de 3800 con la macadamia-33 que sería comparable con las reactividades cruzadas de 0.00036 y 0.00045%.

Amchur Amchur, también deletreado amchoor o aamchur, está hecho de mango verde seco y es de uso frecuente en la gastronomía hindú. El amchur pertenece a la familia del anacardo, Anacardiaceae en el orden de los Sapindales. Por eso no era de extrañar que amchur-i mostró una reactividad cruzada alta con el anacardo-18 y el anacardo-19 con una proporción de 3, cercana al 2.5 interpolado con los dos estándares de calibración que marcan la respuesta con anacardo-18. La similitud con el anacardo se apoya por la disminución en la proporción de 1.5 para las muestras sin diluir, que fue también comparable con la relación extrapolada de los estándares de calibración. No se logró entender la falta de reactividad cruzada de amchur-ii con anacardo-19 ya que, en una proporción de 3, debería observarse una respuesta de al menos el doble de la magnitud del límite de cuantificación (S1, 200 IMF). Como se observa con el anacardo, también se observó una ligera reactividad cruzada con los anticuerpos de avellana, pistacho y nuez. De manera inesperada, se observó una reactividad cruzada con gluten y cacahuate. Amchur-i y amchur-ii mostraron una reactividad cruzada con gluten-28 de 0.0005 y 0.00006% y relaciones de gluten 27/gluten 28 de 0.1 y 0.18, de manera respectiva, comparable con 0.12 y 0.14 de los estándares de calibración. Del mismo modo, amchur-i y amchur-ii mostraron una reactividad cruzada de 0.00012 y 0.00005% con cacahuate-37 y proporciones de 1.3 y 1.0 que fueron indistinguibles de las proporciones determinadas con los estándares de calibración. Para decidir si estas mediciones de reactividad cruzada se pueden utilizar para detectar y distinguir de forma fiable el amchur de los anacardos, cacahuate u otros alérgenos, se requiere realizar nuevas pruebas de muestras adicionales de amchur, de preferencia con materiales de referencia certificados. Sin embargo, si las reactividades cruzadas se debieron a la presencia de gluten y cacahuate no declarados, las concentraciones serían sólo 5 y 0.6 ppm de gluten y 1.2 y 0.5 ppm de cacahuate en amchur-i y amchur-ii, de manera respectiva.

El análisis de extractos desnaturalizados-reducidos preparados a partir de amchur-i y amchur-ii se presentan en la Tabla 4. Amchur-i no mostró una reactividad cruzada significativa con ninguno de los anticuerpos en el aspecto desnaturalizado-reducido del ensayo. Es poco probable la presencia de gluten y cacahuate no declarados en las muestras de amchur, al considerar los resultados desnaturalizados-reducidos; amchur-i no mostró reactividad cruzada ni con gluten-73 ni con cacahuate-72 a pesar de mostrar respuestas de 3400, 12,000 y 9100 con los conjuntos de perlas de detergente amortiguador de gluten-28, cacahuate-37 y cacahuate-38, de forma respectiva. Amchur-ii mostró un patrón similar, con una MFI que fue significativo con gluten-28 (690), cacahuate-37 (2900) y cacahuate-38 (2900) pero con una respuesta no medible con gluten-73 y una reactividad cruzada baja con el cacahuate-72 (610). De hecho, las reactividades cruzadas bajas comparables que se mostraron con amchur-ii y huevo-65, leche-66 y leche-67 indican que la baja respuesta con cacahuate-72 puede deberse a una unión no específica con la respuesta negativa asociada con gluten-73 que refleja una MFI mucho más grande, que define el límite inferior de la medida (S1, 2850) para gluten-73 ( el histórico, S0 es 75 ± 2); los límites inferiores para la medida (S1) para huevo-65, leche-66, leche-67 y cacahuate-72 fueron de 114, 130, 560 y 63,  de forma respectiva.

Especificidad reducida-desnaturalizada El patrón de reactividad cruzada (baja) de intensidad comparable con huevo-65, leche-66, leche-67, y cacahuate-72 pero sin ninguna respuesta medible con gluten-73 para varios suplementos dietéticos y especias se indica en las Tablas 4 y 5 y puede reflejar una rigurosidad baja por los extractos de SDS/β-mercaptoetanol diluidos 100 veces, combinados con un límite en extremo alto de medida (S1) para gluten-73. Consistentes con esta explicación son las proporciones de leche-66/leche-67 para todos menos dos de los suplementos dietéticos y especias enumerados en las Tablas 4 y 5. De manera ideal, la unión no específica no debe mostrar preferencia con el conjunto de perlas y, por lo tanto, una relación de 1, siempre que el proceso de conjugación no cambie de manera sustancial y diferencial las propiedades de unión no específica de las series de perlas. Los estándares de calibración para la leche mostraron una proporción promedio de leche-66/leche-67 de 0.31 ± 0.09 (n = 33) con valores que van desde 0.18 a 0.50 (ESM Tabla S2b). En contraste, las proporciones de leche-66/leche-67 en las tablas 4 y 5 promediaron 0.98 ± 0.11 (n = 4) y 0.85 ± 0.27 (n = 16), de manera respectiva, con resultados en la Tabla 5 que mejoraron a 0.93 ± 0.19 (n = 14) al eliminar los dos resultados que estuvieron dentro del rango definido por los estándares de calibración. Tal reactividad cruzada no específica no se observó con los extractos de detergentes amortiguadores debido al uso del amortiguador UD, diseñado de manera específica para minimizar la lectina y otras uniones inespecíficas. La ocurrencia de esta vinculación no específica asociada con el análisis de productos vegetales puros se espera que no sea un problema con las muestras de alimentos complejos que imitan el potencial de bloqueo de la memoria intermedia UD y por lo tanto mejoran la rigurosidad del ensayo. Más investigación sobre el uso de la extracción de SDS/β-mercaptoetanol y la necesidad de diluciones posteriores para facilitar la unión del anticuerpo pueden ayudar a mejorar este problema.

Mango africano El mango africano es un miembro de la orden Malpighiales y no se relaciona con ninguno de los mangos o el amchur que se consumen de forma habitual (orden Sapindales). Por lo tanto, no es de extrañar que el mango africano no mostrara una reactividad cruzada similar con el amchur no relacionado. Las únicas reactividades cruzadas observadas para el mango africano-i fueron con el gluten-28 (MFI 390, 0.00002%) y el pistacho-43 (MFI 2700, 0.00007%) sin reactividades cruzadas para el mango africano-ii.

Cardamomo El cardamomo, también conocido como cardamum, es una especia que muestra una asociación rara con la anafilaxia y se asocia con efectos positivos para la salud en parte debido a su efecto antioxidante y su capacidad de eliminación de radicales libres. En el xMAP FADA se compararon el cardamomo preparado a partir de dos fuentes i-semillas enteras y ii-premolido. Tanto cardamomo-i como cardamomo-ii mostraron propiedades similares, con reactividad cruzada con coco (0.01 y 0.002% con coco-20) y nuez (0.0007% para ambas muestras con nuez-47) que no se debieron a la presencia de coco o nuez; el promedio de la proporción coco-20/coco-21 fue de 3.8 y la proporción de nogal-47/nogal-48 fue de 1.9, ambos difirieron de las proporciones de 44-55 y 4.6 de los estándares de calibración, de forma respectiva. Las reactividades cruzadas con gluten-28 (0.00003%, 0.00007%), avellana-29 (0.00016%), macadamia-33 (0.0016%, 0.0012%) y piñones-39 (0.0002%) fueron mayores de manera significativa que los límites de cuantificación, pero aparte de macadamia-33, fueron inconsecuentes de forma relativa.

Arándanos Son raros los casos de alergias alimentarias debidas al arándano (Vaccinium macrocarpon) con el único caso de estudio detallado de una alergia alimentaria fue un reporte reciente que describe un caso debido al arándano silvestre relacionado de forma estrecha (Vaccinium vitis-idaea L.) en una mujer de 25 años sin historia de alergias alimentarias. Se examinaron seis muestras de arándanos con el xMAP FADA. Arándano-i, -ii y -iii fueron muestras de referencia de control, mientras que iv, v, y vi eran productos de suplementos dietéticos que contenían varios aditivos como se enumeran en ESM de la Tabla S1. Arándano-i, fue un arándano fresco crudo y arándano-iii fue un arándano liofilizado en laboratorio (arándano-iii). Ninguno de los dos mostró alguna reactividad cruzada con cualquiera de los anticuerpos en el xMAP Fada. En contraste, los cuatro productos industriales, arándano-ii, arándano-iv, arándano-v y arándano-vi, mostraron reactividad cruzada. No es obvio por qué el procesamiento industrial produjo las reactividades cruzadas observadas, pero la magnitud de las reactividades cruzadas fue pequeña (<0.01%, de forma típica <0.002%) y sólo la reactividad cruzada de arándano-iv y arándano-v con los anticuerpos de anacardo (conjuntos de perlas -18 y -19) fue característica del anacardo. En concreto, las  cuatro  muestras de arándano fueron productos industriales (arándano-ii, arándano-iv, arándano-v, y arándano-vi) mostraron reactividad cruzada con los anticuerpos del anacardo (relaciones 0.9, 3, 3.4, 1.3; Estándar de calibración 2.5, 3.1, 3.1, 2.9), los anticuerpos de la avellana (relaciones 1.9–2.8, Estándar de calibración 3.9–4.2), los anticuerpos de la nuez (proporciones 0.3–1.5, Estándar de calibración 3.6–4.6), el pistacho-44 y de las nueces del Brasil-14. El Arándano-ii también mostró reactividad cruzada con los anticuerpos del coco (relación 20, calibración estándar 47), los anticuerpos de macadamia (relación 7, calibración estándar 14), almendra 13, nuez de Brasil-15 (relación 16, calibración estándar 3.6) y gluten-27. Arándano-vi mostró una reactividad cruzada baja con almendra-13, nuez de Brasil-15 (relación 24, calibración estándar 3.8), coco-21, gluten-27, macadamia-34 y soya-45.

Arándanos azules Los arándanos azules pertenecen al mismo género que el arándano, Vaccinium. Al igual que las alergias al arándano, las alergias a los arándanos azules son raras con datos que implican una proteína de transferencia de lípidos de 10 kDa (LTP) como alérgeno importante. Por lo tanto, fue interesante comparar los patrones de reactividad cruzada con aquellos observados con muestras análogas de arándanos. Arándano azul-i y arándano azul ii eran productos comerciales. Arándano azul-i y arándano azul-ii consistían en bayas liofilizadas de manera comercial. Arándano azul-ii, al igual que el arándano vi, contenía gelatina agregada, sílice y estearato de magnesio con la única diferencia notable de la adición de polvo de arroz. Arándano azul-i y arándano azul-ii generaron perfiles similares entre sí con los diversos anticuerpos y fueron similares a los perfiles exhibidos por arándano-ii y arándano-vi con el añadido menor de una reactividad cruzada con almendra-12, gluten-28 y piñones-39. Las reactividades cruzadas exhibidas por las muestras de arándanos fueron de forma típica <0.0002%, excepto con nogal-47 al 0.0007%. Si los arándanos azules frescos y los arándanos azules liofilizados en laboratorio muestran la misma falta de reactividad cruzada que las muestras de arándano (i y iii) necesita explorarse en conjunto para ver si en el proceso de fabricación comercial se agregaron otros agentes que no cumplían los criterios de inclusión para mostrarse en la etiqueta del ingrediente, pero que podrían explicar el patrón bajo de reactividad cruzada observado.

Ají picante Tres productos de ají picante rojo cayena (Capsicum annuum L.) se examinaron y designaron como: Pimienta roja de cayena-i; ají cayena-ii, y ají chipotle pimienta-iii. Tanto pimenta roja de Cayena-i como ají chipotle-iii son producidos por el mismo fabricante y mostraron reactividad cruzada con 11 y 10 de 25 anticuerpos, de manera respectiva, en el componente de amortiguador-detergente del xMAP FADA. Ají Cayena-ii se etiquetó como orgánico y mostró reactividad cruzada con 19 de los 25 anticuerpos. La mayor parte de las reactividades cruzadas observadas con ají Cayena-ii fue bajo (<0.001) excepto con nogal-47 en 0.13% (relación ≤0.7, Estándar de calibración de 4.8), con nuez del Brasil al 0.006% (proporción 4.4, Estándar de calibración de 4.2) y avellana-29 al 0.004% (relación 1.9, Estándar de calibración de 5.2); el resto se tipificó por el anacardo-18 al 0.0006%, la macadamia al 0.0005% y el coco-20 al 0.0002%. La reactividad cruzada con la nuez del Brasil por parte del ají Cayena-ii muestra una proporción de nuez de Brasil-14/nuez de Brasil-15 comparable con aquella de los estándares de calibración. Para determinar si esto era único con esa muestra o más bien una propiedad común del chile rojo de Cayena, las proporciones generadas por Cayena-i y ají chipotle-iii se compararon. Cayena-i y ají chipotle-iii tuvieron una reactividad cruzada con la nuez del Brasil-14 en 0.0002%, con la relación nuez del Brasil-14/ nuez del Brasil-15 de 7 y 7.3, de manera respectiva, que fue diferente de las proporciones observadas con los estándares de calibración comparables (4.2 y 4.5). Así, la reactividad cruzada observada con ají Cayena-ii fue única con esta muestra específica. No se pudo determinar con los datos actuales si esto se debió al uso de un cultivar diferente, los cultivos, las condiciones de crecimiento (por ejemplo, la temperatura, los nutrientes—orgánico versus inorgánico), o a un efecto del procesamiento de los alimentos.

Semilla de amapola Otra especia/suplemento dietético que mostró reactividad cruzada con la mayoría de los anticuerpos en la parte del detergente-amortiguador de xMAP FADA fue la semilla de amapola. Se examinaron dos muestras de semillas de amapola: semilla de amapola-i, que se adquirió en forma de semillas enteras y se molió en el laboratorio y semilla de amapola-ii, premolida por el fabricante. Semilla de amapola-i, reaccionó de forma cruzada con 16 anticuerpos y semilla de amapola-ii reaccionó de forma cruzada con 22 de los 25 anticuerpos. La reactividad cruzada de las muestras de semillas de amapola, en especial de semillas de amapola-ii, fue típica de la unión no específica. De hecho, aunque la MFI con crustáceo-22 estaba por debajo del límite de cuantificación, fue bastante mayor de lo que se observó con otras especias y suplementos dietéticos (por ejemplo, 30 versus ≤5 de forma típica). Antes de una sobreinterpretación, se necesita más investigación para determinar si las reactividades cruzadas fueron un artefacto debido a una rigurosidad insuficiente en las condiciones de unión, extracción de una muestra ineficiente o variabilidad de la muestra.

Semillas de sésamo Dos muestras de semillas de sésamo, ambas preparadas a partir de semillas enteras molidas en el laboratorio, mostraron perfiles similares de reacción cruzada con 11 de los 25 anticuerpos en la parte detergente-amortiguador del xMAP FADA. De manera específica, se observaron cantidades bajas de reactividad cruzada con ambas muestras de nuez del Brasil, ambos anacardos, ambas avellanas y ambos anticuerpos de nuez a 0.00019, 0.00002, 0.0001 y 0.0009% para anacardo-18, avellana-29, y nuez-47, de forma respectiva. Se observó una reactividad cruzada adicional con coco-21, gluten-27 y pistacho-44. Aunque los perfiles eran similares, las magnitudes fueron diferentes, con sésamo-ii que fue en general mayor.

Rauvolfia serpentina (Raíz de serpiente india) La muestra de raíz de serpiente india-ii, después de una dilución de 100 veces, mostró una proporción de MFI gluten-27/gluten-28 de 0.16, comparable con la proporción de 0.14 mostrada con los estándares de calibración. La magnitud de la respuesta MFI por el gluten-28 con la muestra de raíz de serpiente india-ii diluida 100 veces fue de 1390, que es equivalente a una reactividad cruzada de 0.011% o un contenido de gluten de 110 ppm. Como se indicó antes, desde el momento que no se hizo una advertencia voluntaria “libre de gluten” en la etiqueta de la muestra de Rauvolfia serpentina, el producto no está sujeto a ninguno de los requisitos de la regulación “libre de gluten”, que incluye el requisito de que contiene “menos de 20 ppm de gluten”. En contraste, la muestra raíz de serpiente india-i fue un material de referencia puro obtenido de la NCNPR y, en consecuencia, no mostró reactividad cruzada con el gluten-27 y tuvo una MFI de 332 con gluten-28. Si la MFI de 332 con gluten-28 fue debida al gluten (que no es compatible por la incapacidad de detectar una respuesta medible con glúten-27), la cantidad máxima posible debería ser de 0.2 ppm basada en una reactividad cruzada de 0.00002%. La raíz de serpiente india-ii también mostró una MFI baja (reactividad cruzada) con 11 anticuerpos diferentes al gluten. En contraste, la raíz de serpiente india-i sólo mostró una reactividad cruzada adicional con coco-20 y coco-21, que no se observó con la raíz de serpiente india-ii. La conclusión de que la raíz de serpiente india-ii contiene gluten se respaldó por el análisis del desnaturalizado-reducido de las muestras de raíz de serpiente india. La raíz de serpiente india-i dio negativo para todos los analitos en la parte desnaturalizada-reducida del xMAP FADA, mientras que la raíz de serpiente-india ii dio positivo sólo para el gluten (MFI 5186).

Germinado de trigo Se estudió el germinado de trigo de dos fuentes: germinado de trigo-i que se etiquetó con la advertencia voluntaria “libre de gluten” y en consecuencia no mostró reactividad cruzada con ninguno de los anticuerpos contra el gluten y con ninguno de los otros anticuerpos asociados con el detergente-amortiguador xMAP FADA. Al contario, el germinado de trigo-ii, donde no se hizo una advertencia voluntaria libre de gluten, mostró reactividad cruzada con gluten-27 y con gluten-28, que generó una proporción de 0.14 comparable con la de 0.16 observada con los estándares de calibración. Como se apoyó por el análisis de la proporción, la MFI de gluten-28, después de una dilución de diez veces, fue de 1884 y es equivalente a una reactividad cruzada de 0.002% o a un contenido de gluten de 20 ppm. La conclusión de que el germinado de trigo-ii contiene gluten se apoya por los análisis de desnaturalización-reducción de las muestras de germinado de trigo. El germinado de trigo-i fue negativo para todos los analitos de la porción desnaturalizada-reducida del xMAP FADA, mientras que el germinado de trigo-ii dio positivo sólo para gluten (MFI 10,721).

Salvia La salvia también mostró índices de que el gluten estaba presente, pero la MFI promedio de salvia-i fue insignificante y la proporción gluten 27/gluten-28 para salvia-i y ambas concentraciones de salvia-ii (0.25, 0.31, y 0.41) fueron inconsistentes con las proporciones de los estándares comparables de calibración (0.14, 0.12 y 0.10). Aunque las dos muestras de salvia dieron positivo en el análisis de reducción-desnaturalización del gluten, ambas muestras de salvia también fueron positivas para los otros cuatro analitos, lo que indica una posible falta de especificidad o de unión no específica. Una revisión de los análisis en la Tabla 5 indica un número alto de muestras que muestran reactividad cruzada con huevo-65, leche-66, leche-67 y cacahuate-71 donde algunas de ellas mostraron respuestas positivas no comparables con gluten-73. El gluten-73 muestra una definición de MFI más alta que define el límite más bajo para la medición del gluten (S1, ESM Tabla S2b; 25). Por lo tanto, sería consistente con la unión no específica para dejar de observar una respuesta con gluten-73 hasta que la cantidad de unión no específica supere un umbral. La salvia mostró la unión más inespecífica como lo ejemplifican las respuestas de las MFI con huevo-65, leche-66, leche-67 y cacahuate-72; consistentes con salvia que supera el umbral más alto para generar una respuesta medible con gluten-73. Por último, todo esto es intrascendente desde una perspectiva de salud o regulatoria a partir de que la MFI de 3070 para salvia-ii con gluten-28 (0.0003% de reactividad cruzada) indicaría un máximo de solo 3 ppm si el gluten fuera la causa de la respuesta medida.

Polen de abeja El polen de abeja fue el foco de varios estudios sobre reactividad cruzada entre polen y los alérgenos alimentarios. Se examinaron dos muestras de polen de abeja. Ninguna de los dos mostró reactividad cruzada con algún grupo de perlas de la parte amortiguador-detergente. Sólo el polen de abeja-ii mostró reactividad cruzada con los grupos de perlas de detergente-reducido. Sin embargo, el patrón de reactividad cruzada con los grupos de perlas 65, 66, 67, 72 pero no el 73 fue consistente con la posibilidad de dicha reactividad cruzada debido a una unión no específica, así como se observa con amchur-ii y salvia (ver arriba). Sin embargo, los valores de MFI observados con los conjuntos de perlas desnaturalizadas-reducidas no fueron de manera perfecta una característica de la unión no específica. La proporción leche-66/leche-67 fue de 1.3, que es mayor de forma significativa que la observada con los otros suplementos dietéticos y especias (promedio 0.94 ± 0.17, n = 18). Además, la MFI observada con leche-66 y leche-67 fue bastante mayor que la IMF observada con huevo-65 y cacahuate-72, un patrón también observado con la hierba de eneldo. Por esto, por lo tanto, sería interesante determinar si otros “pólenes de abeja” de diferentes orígenes florales y productos de eneldo muestran propiedades similares y si la reactividad cruzada se mostraría en otras pruebas basadas en anticuerpos específicos para la leche y otras pruebas de identidad de antígeno (por ejemplo, análisis de transferencia Western blot y análisis espectral de masas purificado por inmunoafinidad de péptidos antigénicos).

Espirulina La espirulina es un alga verde azul/cianobacteria que se consume como suplemento dietético por su valor nutricional. Un caso reportado de anafilaxia atribuido a la ingestión de espirulina aumentó el interés por comprender su alergenicidad y cualquier reactividad cruzada con alérgenos alimentarios. Se analizaron tres diferentes productos de espirulina y se observó solo una reactividad cruzada muy débil (75-103) para los tres productos con piñón-42 pero sin reactividad cruzada con piñón-39 o cualquiera de los otros conjuntos de perlas en cualquiera de los otros grupos de perlas tanto en las partes de amortiguador- detergente como en las partes desnaturalizadas-reducidas de la prueba. Este resultado era inusual, ya que el piñón muestra una proporción de forma normal de piñón-39/piñon-42 de 6–7 para los estándares de calibración en intensidades comparables. Como tal, la falta de cualquier MFI medible con piñón-39 es de forma clara diferente a la de piñón.

Misceláneos Los ingredientes botánicos restantes (por ejemplo, pimienta de Jamaica, pimienta negra, semilla de alcaravea) sólo mostraron una ligera reactividad cruzada con pocos de los anticuerpos en niveles de reproductibilidad por encima de los límites de cuantificación (S1) pero de forma típica <1 ppm si el alérgeno sospechoso estaba presente.

Conclusión La cosensibilización entre productos (por ejemplo, flores, fruta/semilla, hojas, raíces y tallos) derivados de diferentes plantas se estableció y observó bien en RAST y pruebas cutáneas por punción. Mientras que las pruebas clínicas o las pruebas basadas en actividad biológica son enfoques ideales, esta reactividad cruzada es detectable de manera potencial al usar la antigenicidad, con pruebas basadas en anticuerpos que se utilizan para detectar alérgenos alimentarios. El xMAP FADA, en virtud de su sensibilidad, su rango dinámico amplio y su capacidad para detectar la reactividad cruzada hacia múltiples anticuerpos proporciona una rara oportunidad para estudiar esta reactividad cruzada y da la capacidad para detectar y distinguir entre alimento alergénico y alergénico en potencia. El análisis de productos botánicos vendidos como suplementos dietéticos y especias rara vez mostró reactividades cruzadas en el xMAP FADA. Las reactividades cruzadas, cuando se observaron, fueron de intensidad baja que requirieron el uso de muestras puras o casi puras para su detección. Como resultado, las reactividades cruzadas observadas tenían pocas probabilidades de causar problemas analíticos o plantear una preocupación cuando se consumen en porciones orales típicas. Fue fundamental para estas comparaciones el uso de anticuerpos con diferentes constantes de afinidad y especificidad. El objetivo de usar anticuerpos sólo de alta afinidad y especificidad (como se usan en ELISA) es en potencia contraproducente en el xMAP FADA donde la reactividad cruzada permite el perfilado multianticuerpo y la detección de nuevos analitos. En definitiva, debe ser posible la correlación filogenética cuando el número y tipo de productos de referencia examinados se expande.

Pedersen RO, Nowatzke WL, Cho CY, Oliver KG, Garber EAE. Cross-reactivity by botanicals used in dietary supplements and spices using the multiplex xMAP food allergen detection assay (xMAP FADA). Anal Bioanal Chem. 2018 Sep;410(23):5791-5806. doi: 10.1007/s00216-018-1187-3.

Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México

Dra. Med. Sandra Nora González Díaz          Jefe y Profesor

Dr. Alfredo Arias Cruz                                Profesor

Dr. Iván Omar Peñafiel Quinteros                Residente 1er Año

Dra. Alejandra Macías Weinmann                Profesor