La ambrosía (Ambrosia artemisiifolia L.) es una maleza anual, nativa de Norteamérica e ingresada a Europa de manera accidental, probablemente por importación de semillas, durante el siglo 19. Al momento, en Europa, esta planta extranjera es un gran problema ya que es una de las especies invasivas más prominentes. Tiene impactos negativos sobre la biodiversidad, el rendimiento de los cultivos y la salud humana al causr alergia respiratoria. En este sentido, se demostró la Ambrosia artemisiifolia como una de las principales especies alergénicas en Europa. El alérgeno mayor del polen de ambrosía es Amb a 1. Más de 90% de los pacientes sensibilizados a la ambrosía reaccionan en las pruebas cutáneas y al menos 90% de la actividad alergénica en el polen de ambrosia se puede atribuir a esta proteína. Amb a 1 pertenece a la familia de la pectato liasa y muestra varias isoformas genéticas (Amb a 1.1, Amb a 1.2, Amb a 1.3, Amb a 1.4, Amb a 1.5).
La alergenicidad del polen, definida como la habilidad del polen para provocar una reacción mediada por IgE en pacientes atópicos y principalmente debido al tipo y contenido de los alérgenos, se reconoce de manera amplia como un determinante mayor de los efectos de salud para los pacientes sensibilizados y varía en el polen de plantas individuales de forma geográfica y temporal. Lee y Want, por ejemplo, demostraron varias diferencias en la alergenicidad entre y dentro de especies de ambrosía, aunque no queda claro si estas diferencias fueron genotípicas o fenotípicas. Varios trabajos demostraron que la contaminación puede influir en el contenido de alérgenos del polen. Por ejemplo, Ghiani y colaboradores reportaron un aumento en la alergenicidad del polen de plantas de ambrosia que crecen a lo largo de calles contaminadas por tráfico. Se sugirió que el cambio climático también afecta la alergenicidad del polen, aunque, en este caso, las investigaciones se dirigieron principalmente al estudio y la predicción del efecto de la temperatura y el CO₂ en el aumento sobre la producción y la dispersión del polen; sólo algunos estudios se realizaron para definir el papel de los factores climáticos en alterar la actividad alergénica del polen, lo que aún no se explora. Por ejemplo, se mostró que el contenido de la proteína alergénica mayor Bet v 1 de abedul aumentó a mayores temperaturas, así como el contenido de polen de ambrosía Amb a 1 se incrementó en función del aumento de la concentración atmosférica de CO₂.

Sin embargo, muchos otros factores, tanto genéticos y abióticos pueden influir sobre la expresión de alérgenos y aún se desconoce si el contenido de antígeno es tanto función de las condiciones ambientales o se determina de forma genética. Además, la alergenicidad del polen depende no sólo de la cantidad de alérgeno, sino del tipo de alérgenos expresados; por ejemplo, la alergenicidad del polen de ambrosía depende principalmente del contenido total de proteínas Amb a 1 en la presencia de diferentes isoformas de Amb a 1, cuyo potencial alergénico único aún no se dilucida de forma completa.

En este trabajo se estudió la variación en la expresión de isoformas Amb a 1 y su inmunorreactividad IgE entre y dentro de poblaciones de ambrosía para determinar la contribución de factores genéticos y ambientales a la alergenicidad del polen y para comprender los mecanismos moleculares subyacentes. De manera específica, al cultivar plantas de ambrosía en condiciones estándar, donde la temperatura (T), la humedad relativa (RH) y la luz (L) cambian durante el desarrollo de la planta, y en condiciones controladas donde los parámetros ambientales (T, RH, L) se mantienen constantes durante el ciclo completo de vida, se quiso evaluar si: (i) la alergenicidad del polen se determina de forma genética o se influencia por condiciones de crecimiento; y (ii) si las diferencias entre los individuos reflejan diferencias en la expresión cuantitativa/cualitativa de las isoformas individuales.

Resultados

Alergenicidad total de polen de plantas individuales. Se aplicó la técnica de slot blot para evaluar la alergenicidad total del polen de cada una de las plantas cultivadas en condiciones controladas o estándar. Se unieron volúmenes de extractos de polen idénticos y comparables en una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a inmunorreacción con una mezcla de sueros de pacientes seleccionados con alergia a la ambrosia. Se aplicó análisis de imagen para cuantificar señales inmunoquímicas: se midió la densidad óptica integrada (IOD) de spots inmunoreactivos con respecto a la IOD del estándar (IOD muestra/IOD estándar). Se analizaron al menos 3 extractos de proteína de cada planta, y los resultados promedio de 5 experimentos independientes se calcularon y elaboraron de manera estadística (Fig. 2). En promedio, la señal de reactividad de las muestras de polen de las plantas cultivadas en condiciones controladas fue de 0.89 a 1.22 con valor de varianza de 0.01 (Fig. 2A). No se encontró una diferencia significativa (P < 0.01) entre los valores IOD promedio para poblaciones italianas (1.07 + 0.03), francesas (1.10 + 0.04) y canadienses (1.03 + 0.03). El polen de plantas cultivadas en condiciones estándar mostró señales de reactividad de 0.56 a 2.19 con una varianza mucho más alta (0.20; P < 0.001) que aquellas de muestras de polen de plantas cultivadas en condiciones controladas constantes (fig. 2B). El valor promedio de IOD de poblaciones italianas (1.12 + 0.12), francesas (1.09 + 0.14) y canadienses (1.02 + 0.06) no fue estadísticamente diferente para estas plantas (P < 0.05). De manera independiente del origen de las semillas, las señales de reactividad promedio se clasificaron de forma estadística en 4 grupos significativamente diferentes (P < 0.001): (1) bajo: 0.56<IOD<0.75; (2) bajo-medio: 0.78<IOD<1.19; (3) medio-alto: 01.27<IOD<1.50 y (4) alto: 1.81<IOD<2.19.

Expresión y reactividad IgE de isoformas de Amb a 1 en polen de plantas individuales. Para comprender la alta variabilidad en la alergenicidad total encontrada entre las plantas cultivadas en condiciones estándar y si se adscribe a diferentes cantidades de Amb a 1, se realizaron 1D-SDS-PAGE e inmunoblot. Se analizó el polen de 9 plantas elegidas de forma aleatoria de los grupos de reactividad a IgE baja, media y alta que resultaron del análisis en racimo de resultados de slot blot. Nueve plantas adicionales cultivadas en condiciones controladas también se consideraron como referencia. Se cargaron volúmenes iguales de extractos y volúmenes de proteínas. Mediante análisis de imagen en gel teñida con azul de Coomassie y en membranas inmunoblot, se sondearon con la misma mezcla de suero utilizada para slot blot, se confirmaron los resultados de slot blot y mostró un contenido significativamente menor de alérgenos Amb 1 (P < 0.05) en muestras con mejor reactividad, lo que indica una relación directa entre el contenido de Amb a 1 y la alergenicidad del polen. (Correlación de Pearson = 0.98 P < 0.001 para grupo estándar, 0.78 P < 0.05 para el grupo control).

Las mismas muestras de polen se analizaron en paralelo con 2D-SDS-PAGE e inmunoblot para comprender si una expresión diferencial y/o la reactividad de las isoformas Amb a 1 individuales contribuyeron a la alta variabilidad de reactividad de IgE del polen de las plantas cultivadas en condiciones estándar. En este caso se cargaron cantidades iguales de proteínas en gel. La figura 4 muestra las membranas representativas después de la inmunodetección los geles relacionados teñidos con Azul Coomasie. No se encontró una variación constante en presencia/intensidad relativa en el spot en geles y membranas al compararse con el mapa de referencia desarrollado y publicado de forma previa por los autores. Se sugirió que la gran variabilidad observada en la alergenicidad del polen de plantas cultivadas en condiciones estándar no se adscribió a una expresión relativa diferente y la reactividad IgE de las isoformas individuales consideradas.

En el conjunto la electroforesis y los análisis por inmunoblot indicaron que la variabilidad de alergenicidad del polen se relacionó principalmente al contenido del alérgeno Amb a 1 en el polen y no a una expresión relativa diferente y la reactividad de sus principales isoformas individuales.

Discusión

La introducción y la naturalización de Ambrosia artemisiifolia L. a Europa impacta en la salud humana debido a que produce grandes cantidades de polen altamente alergénico, y representa una de las principales causas de polinosis en muchas regiones. En el norte de Italia, aunque está presente desde el inicio del siglo XX, la ambrosía común se convirtió en la segunda causa de alergia respiratoria en las últimas dos décadas. Entre los factores que influyen en la polinosis, la potencia alergénica de un polen es un elemento importante que tomar en cuenta. De hecho, además de los cambios antropogénicos y ambientales que llevan a la difusión de la planta y a la mayor liberación de polen a la atmósfera, la alergenicidad del polen también puede influir en la prevalencia y/o la gravedad de las enfermedades alérgicas. Sin embargo, está por determinarse cómo el genotipo y el medio ambiente contribuyen a determinar la alergenicidad del polen de ambrosia.

En este trabajo se demostró que las variaciones en la alergenicidad del polen de ambrosia son principalmente debido a variaciones climáticas estacionales (T, RH, L) que ocurren durante el desarrollo de la planta y en particular durante la temporada de floración, la cual es específica para cada planta. Se encontró que el polen de plantas cultivadas en condiciones constantes mostró potencia alergénica similar, mientras que el polen de plantas sujetas a temperatura, humedad relativa y cambios estacionales ligeros mostró una alta variabilidad en la alergenicidad. Además, se encontró que también flores de la misma planta producen polen con diferentes potencias alergénicas sólo cuando se desarrollan bajo condiciones variables.

Estudios previos sobre ambrosia demostraron que el contenido de su alérgeno mayor Amb a 1 varía en plantas de sitio a sitio e incluso de año a año en el mismo sitio. Para otras especies de plantas alergénicas, la concentración de alérgenos mayores de polen puede diferir entre las plantas en función de las condiciones climáticas. Por ejemplo, Ahlholm y colaboradores indicaron que el contenido de la proteína de alérgeno mayor Bet v 1 del abedul aumentó a mayores temperaturas y Saito y Teranishi, al comparar la concentración del alérgeno mayor Cry j 1 del sugi (Cryptomeria japónica) de cuatro individuos de una clona en crecimiento a un sitio de baja altitud y alta altitud, encontraron que la concentración de Cry j 1 fue mayor en el polen recolectado en el sitio de baja altitud. De manera específica, estos autores especularon que las diferencias entre las temperaturas medias de 1.1 y 1.5ºC podrían causar cambios en la concentración de alérgenos de Bet v 1 y Cry j 1, de manera respectiva. Sin embargo, Goto y colaboradores al estudiar un número mayor de clones sugi, reportaron que la concentración de Cry j 1 se controla principalmente por factores genéticos.

Los resultados de este estudio indican un principal control de la alergenicidad del polen de la ambrosia mediado por factores ambientales que llevan a modificaciones fenotípicas no heredables de forma meiótica. Sin embargo, la baja variabilidad en la alergenicidad que se encontró entre plantas cultivadas en condiciones controladas constantes sugiere que existen diferencias genotípicas heredables entre las plantas e influyen, aunque a menor grado que el medio ambiente, en la alergenicidad final del polen. Muy probablemente refleja el alto flujo de genes que existe entre las plantas de ambrosía, lo cual determina una variabilidad genética que es muy alta entre las plantas individuales y muy baja entre las poblaciones. En consecuencia, en los experimentos, la alergenicidad fue específica para plantas individuales de forma independiente de su origen. De manera interesante, también el tiempo de floración fue específico para plantas individuales, pero las diferencias entre las plantas fueron consistentes y similares en condiciones constantes y estándar, lo que sugiere que este carácter, a diferencia de la alergenicidad, se determina por factores genéticos o epigenéticos heredables. Además, en concordancia con la literatura, se reporta un aumento en la concentración de Amb a 1 en el polen inducido por cambios climáticos o contaminantes, el experimento muestra que los factores ambientales actúan por medio de un mecanismo molecular que regula el contenido de polen de todas las isoformas consideradas de Amb a 1. No se observó una expresión preferencial consistente de isoformas específicas de Amb a 1. Este mecanismo debería involucrar un control epigenético de alergenicidad del polen como se reportó para varios procesos adaptativos al estrés ambiental. Por ejemplo, El Kelish y colaboradores observaron un aumento en el mRNA principal de Amb a 1 en el polen de plantas expuestas a altas concentraciones de CO₂ bajo el estrés de la sequía. Se puede especular que el cambio en la concentración de Amb a 1 en el polen puede ser un mecanismo de adaptación por las plantas de ambrosia para favorecer su reproducción. Las proteínas de Amb a 1 podrían pertenecer de hecho a la familia de pectato liasas, cuya actividad está implicada en la emergencia del tubo de crecimiento del polen para iniciar la liberación y la ruptura de la pared celular del polen y además en la penetración del tubo de polen en el tejido transmisor. De manera desafortunada, aunque la modulación del epigenoma en respuesta al medio ambiente da de forma potencial un mecanismo para que los organismos se adapten dentro y entre las generaciones, al momento no se conocen la extensión a la cual ocurre ni los mecanismos moleculares involucrados.

En resumen, este estudio demostró que la potencia alergénica del polen de ambrosia, la cual afecta de forma directa la prevalencia y/o la gravedad de las enfermedades alérgicas, se rige principalmente por factores ambientales. De manera específica, los experimentos demostraron que la alergenicidad del polen depende principalmente de los cambios climáticos que ocurren durante el desarrollo de las plantas y en particular durante la floración. Esta investigación mostró además que el medio ambiente modula la potencia del polen al regular el contenido de todas las isoformas de Amb a 1.

La información da un primer paso en identificar los factores involucrados en la alergenicidad del polen. Experimentos a futuro, orientados a investigar la relación directa entre la alergenicidad del polen, parámetros ambientales únicos y mecanismos epigenéticos, como metilación de DNA, se necesitan para obtener mayor información sobre la influencia de los cambios ambientales en la alergenicidad del polen y su función fisiológica y ecológica.

Métodos

Material de plantas.Se recolectaron semillas de 15 diferentes poblaciones de ambrosia y se utilizaron para obtener plántulas de ambrosia. Para favorecer la germinación, las semillas recolectadas se sometieron a estratificación en frío (4°C) por 30 días y después se sembraron en un medio de cultivo compuesto de 7% agar de planta. Se colocaron placas de Petri en una cámara de crecimiento (20º; 10 horas de oscuridad/14 horas de luz; 300 W m-2) mientras que las 90 plantas restantes se transfirieron a un invernadero y se cultivaron en condiciones estándar, donde la temperatura (T), la humedad relativa (RH) y la luz (L) cambiaron durante la temporada y después durante el desarrollo de la planta.

Las plantas se monitorearon cada día y el polen se recolectó al cubrir los inflourescencias machos con una envoltura de plástico (ARASYSTEM). Las muestras de polen se almacenaron en eppendorf de 2 ml con gel de sílice a temperatura ambiente.

Análisis inmunoquímico. Pacientes y preparación de mezcla de suero. Se utilizó el suero de 12 pacientes adultos seleccionados de forma previa por su habilidad para detectar de manera específica alérgenos de ambrosía para realizar todos los análisis inmunoquímicos. Se consideraron como candidatos potenciales para la inclusión en el estudio pacientes adultos con antecedentes de síntomas respiratorios (rinoconjuntivitis con o sin asma) estacionales en verano (mediados de agosto a finales de septiembre) que se presentaron de manera espontánea a la consulta externa de la Clínica San Carlo (Paderno Dugnano, Italia) para solicitar valoración de alergia. Todos los pacientes se sometieron a pruebas cutáneas por escarificación (SPT) con extractos comerciales (Allergopharma, Reinbeck, Alemania) de los principales aeroalérgenos presentes en Italia, como ambrosía, artemisa, pasto; parietaria, plántago, abedul, olivo y ciprés y resultaron francamente positivos en la SPT con extracto de ambrosía. Todas las investigaciones clínicas se llevaron a cabo de acuerdo a los principios de la Declaración de Helsinki; todos los pacientes dieron su consentimiento escrito para los procedimientos diagnósticos. El estudio se basó en los datos derivados de la actividad clínica de rutina y en sueros utilizados de forma previa en investigaciones clínicas de rutina; el estudio se aprobó por el Consejo de Revisión Institucional de la Clínica San Carlos. Para evitar la interferencia de reactividad cruzada de panalérgenos como la profilina, sólo se consideraron pacientes sensibilizados a menos de 3 pólenes incluyendo ambrosia. Además, la hipersensibilidad a profilina se descartó por SPT negativas a profilina comercial (ALK-Abellò, Madrid, España). La reactividad de 14 sueros individuales se evaluó por inmunoblot con un extracto comercial de proteínas de polen de ambrosia (Allergon, Ängelholm, Suecia). Se seleccionaron doce sueros por su habilidad para detectar alérgenos específicos de ambrosía y se reservaron para llevar a cabo todos los análisis inmunoquímicos. La reserva de suero se alicuotó y almacenó a -20ºC hasta su uso.

Preparación de extractos de proteínas de polen. Los extractos solubles de proteínas se prepararon de acuerdo a Aina y colaboradores al suspender 0.1 g de polen en 1 ml de agua bidestilada estéril con inhibidor de proteasa (PMSF 1 mM). Las muestras se incubaron en un tambor rotatorio por 2 horas a temperatura ambiente. La fracción soluble se aisló mediante 2 centrifugaciones a 13000 g por 10 minutos a 4ºC y después se almacenó a -20ºC hasta su uso.

Al menos cinco extractos independientes se prepararon para cada muestra. Los extractos de proteína se utilizaron para slot blot de proteínas, y análisis por inmunoblot 1D y 2D.

Para slot blot e inmunoblot 1D, las muestras se disolvieron en un buffer de muestra SDS [SDS 2% (p/v), glicerol 10% (v/v), DTT 1 mM, Tris-HCl 62.5 mM, ph 6.8]. Para el análisis de electroforesis 2D, las muestras se purificaron con un kit de limpieza (Laboratorios Bio-Rad) y se disolvieron en buffer de rehidratación IEF [Urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2% (p/v), Tris – Hcl 20mM, ph 8.8, 20 mM DTT, 0.5% mezcla anfolita, pH 3-10, 0.005% azul bromofenol]. Las concentraciones de proteínas se evaluaron con albumina sérica bovina (BSA) como estándar.

Slot blot de proteínas.Se aplicó la técnica de slot blot para evaluar la alergenicidad total de las muestras de polen. El análisis se llevó a cabo de acuerdo a Ghiani y colaboradores. De forma breve, se unieron volúmenes iguales de extractos de proteína (3 µl) a una membrana de celulosa y se tiñeron con solución de Ponceau [Ponceau S 0.1% (p/v) en) ácido acético 5% (v/v] para evaluar la cantidad de proteínas cargadas en cada pozo. Las membranas se utilizaron para evaluar la inmunoreactividad de los diferentes extractos de polen a la mezcla del suero de pacientes alérgicos a ambrosía. Se utilizó como estándar el extracto de proteína de polen comercial (Allergon) para controlar la variación en las tinciones al comparar mediciones referentes a diferentes experimentos. Los controles negativos se realizaron al omitir la mezcla de suero y utilizar una reserva de sueros de pacientes no atópicos. El análisis de imágenes se aplicó para cuantificar señales inmunoquímicas: se midió la densidad óptica integrada (IOD) de los spots inmunoreactivos con respecto al IOD del estándar. Los resultados promedio de cinco experimentos independientes se calcularon y analizaron de manera estadística.

Inmunoblot 1D y 2D.Se realizaron análisis de inmunoblot 1D y 2D para estudiar el cambio en el contenido de isoformas de Amb a 1 y la reactividad de IgE entre las plantas.

Se llevó a cabo el inmunoblot Id de acuerdo al protocolo reportado por Aina y colaboradores. De manera breve, se separaron volúmenes iguales de extracto de pólenes (15 µl/carril) o proteínas (30 µl/carril) por gel de SDS poliacrilamida de acuerdo a Laemmli. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie G-250 coloidal (0.1% azul de Coomassie G250, sulfato de amonio 170 g/L, metanol 34%, ácido fosfórico 3%) o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con polvo de leche sin grasa al 5% (p/v) en TBS-T [Tris 20mM, NaCL 150mM y Tween 20 0.05% (v/v), pH 7.5] por 1 hora y después se incubaron por 16 horas a 4ºC con una dilución 1:10 de la mezcla de sueros de los pacientes alérgicos a ambrosía, y para fines de control, con sueros de adultos no atópicos (dilución 1:10). La IgE unida se detectó con anticuerpos caprinos HRP conjugados anti-IgE humanos (dilución 1:15000; Sigma). Las bandas inmunoreactivas se visualizaron en una película de rayos X (Kodak) con detección de Western Blot ECL Prime (GE Healthcare).

Se realizó inmunoblot 2D de acuerdo a Asero y colaboradores. Se realizó isoelectroenfoque (IEF) en tiras gradientes inmovilizadas de pH (IPG) de 7cm, (Bio-Rad) que dan un gradiente linear de pH 4-7. Las tiras se rehidrataron en 200 µl de buffer de rehidratación (urea 7M, tiourea 2M, CHAPS 2% (p/v), DTT 20 mM, mezcla de portador anfolita 0.5%, azul de bromofenol pH 3-10, 0.005%) con un contenido de 100 µg de muestra de proteína. Se realizó rehidratación pasiva (hasta 10 horas) y IEF a 20ºC con Protean IEF-Cell (Laboratorios Bio-Rad). Después de la primera separación de dimensión, las tiras de IPG se equilibraron por 15 minutos contra urea 6M, glicerol 30%, SDS 2%, Tris HCl de 0.375 M pH 8.8, DTT 2% para resolubilizar las proteínas y reducir los enlaces disulfuro. Los grupos –SH se bloquearon al sustituir el DTT con yodoacetamida 2.5% en el buffer de equilibrio por 15 minutos. Después de equilibrarse, las tiras se colocaron sobre geles de poliacrilamida (14% v/v) verticales de 10 x 9 cm x 1.5 mm. Se cargó una solución de agarosa (agarosa de baja fundición en un tampón de ejecución) sobre el gel para bloquear las tiras, y se realizó electroforesis a 4ºC en un tampón de ejecución (Tris-HCl 25mM pH 8.3, glicina de 19 mM, SDS 0.1%). Los geles se corrieron en la cámara de electroforesis (sistema de electroforesis Mini-Protean, Laboratorios Bio-Rad) en paralelo y se utilizaron para revelar proteínas o experimentos de inmunoblot. Para detectar proteínas, se tiñeron los geles con azul de Coomassie G250 (Azul de Coomassie G250 0.1%, sulfato de amonio 170 g/l, metanol 34%, ácido fosfórico 3%). Para experimentos de inmunodetección, se le realizó electroblot a los geles (100 mA toda la noche a 4ºC) a membranas de nitrocelulosa (0.45 mm, Laboratorios Bio-Rad) por un aparato Trans-Blot cell (Laboratorios Bio-Rad) que contiene buffer de transferencia (Tris 25-mmol/L, L glicina 192 mmol, y metanol 20% [vol/vol], pH 8.3). La saturación del filtro de nitrocelulosa y la reacción con la mezcla de sueros se realizó como se reportó de forma previa para inmunoblot 1D. Se analizaron al menos 3 muestras independientes para cada planta seleccionada. La identificación de isoformas Amb a 1 se realizó mediante análisis de imagen, al comparar los mapas 2D con el mapa de referencia de ambrosia publicado de forma previa por Asero y colaboradores. Antes de la comparación, algunos geles se analizaron mediante LC-MS/MS para confirmar los resultados previos. Como se encontró de forma previa, de manera independiente de dónde se cultivaron las plantas (condiciones estándar o constantes), Amb a 1.01 y Amb a 1.03 fueron las isoformas reactivas a IgE más expresadas en el polen, de manera respectiva; Amb a 1.02 y Amb 1.04 fueron las isoformas menos expresadas.

Estadística. Los datos se analizaron por el programa R para Windows. Se aplicaron ANOVA y test de Turkey para comparar múltiples muestras, cuando se cumplieron la normalidad y homogeneidad de la varianza. Los datos que no conformaron a las suposiciones se transformaron en logaritmos.