La conjuntivitis papilar inducida por lentes de contacto (LC) (CPLC) es una conjuntivitis crónica que se presenta en usuarios de LC. La estimulación física de la conjuntiva palpebral por el propio LC y las reacciones alérgicas a sustancias adheridas a la superficie del LC se consideran entre las causas principales. Aunque aún no se confirman los tipos de depósitos que inducen una reacción alérgica, se prevé que los biodepósitos de proteína desnaturalizada sean una de las etiologías. Las bacterias que se adhieren a la superficie de los LC son posibles alérgenos de la CPLC. Sin embargo, esto no se investigó a profundidad hasta ahora. Tagliaferri et al cultivaron LC recolectados de pacientes con CPLC y reportaron que no hubo asociación entre la CPLC y las bacterias adheridas a la superficie del LC.
Sin embargo, los autores de ese estudio evaluaron la asociación sólo mediante el uso de métodos convencionales de cultivo y no analizaron la población bacteriana a nivel de género. Dado que el uso de LC afecta la superficie ocular mediante diversas bacterias transmitidas por el agua de origen ambiental, y muchas de las bacterias ambientales son exigentes, es deseable la validación de los LC y las soluciones para el cuidado de una manera independiente del cultivo.De manera reciente, el análisis de microbioma que emplea secuenciación de próxima generación (SPG) se aplicó a muestras intestinales, cutáneas, orales y vaginales. Varios estudios analizaron con SPG el microbioma de la superficie ocular de sujetos sanos. Estos estudios reportan que la composición del microbioma de la superficie ocular inferida por SPG difiere mucho de la descrita con anterioridad que utilizó métodos convencionales de cultivo.
Se sabe que los microbiomas están presentes en los órganos humanos, donde contribuyen a mantener la homeostasis de cada órgano y/o la salud humana. Por ejemplo, en un estudio sobre el microbioma intestinal, se descubrió que la alteración y la disbiosis del microbioma intestinal intervienen en el desarrollo de enfermedades no infecciosas, como la obesidad, la diabetes mellitus, las enfermedades autoinmunes y la enfermedad inflamatoria intestinal. Del mismo modo, el microbioma de la superficie ocular puede desempeñar un papel importante en la homeostasis de la superficie ocular, y su alteración puede relacionarse con la aparición y el deterioro de algunas enfermedades oculares no infecciosas. Por lo tanto, el análisis de microbiomas con SPG de la superficie ocular y muestras clínicas oftálmicas puede ayudar a dilucidar la asociación causal entre microorganismos y enfermedades oculares no infecciosas.
En el presente estudio, se realizó un análisis de SPG del microbioma en las soluciones para el cuidado de los LC que permanecen en los estuches de almacenamiento de lentes y los fluidos lagrimales de los usuarios de LC con síntomas alérgicos (SA). Los hallazgos del presente estudio sugieren una posible asociación entre la contaminación bacteriana en el estuche de almacenamiento de los lentes y los síntomas alérgicos.
Materiales y métodos
Perfiles de los participantes. En total, 15 usuarios de LC (9 sujetos con síntomas alérgicos y 6 controles sanos, con edades comprendidas entre los 19 y los 24 años) se inscribieron en el presente estudio (Tabla I). El presente estudio siguió los principios de la Declaración de Helsinki y se aprobó por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kindai (aprobación no. 28-137). Se obtuvo el consentimiento de todos los sujetos después de una explicación de la naturaleza y las posibles consecuencias del estudio. Todos eran voluntarios que usaban lentes de hidrogel blando refractivo, usaban una solución multipropósito para el cuidado de sus lentes y respondieron a las preguntas sobre síntomas alérgicos que se enumeran a continuación (con respecto a los síntomas) después de proporcionar el estuche de almacenamiento de las lentes. Aunque no se pudieron determinar todas las marcas de lentes y soluciones para el cuidado, las soluciones para el cuidado incluidas en el presente estudio contenían cloruro de polidronio o polihexametilen biguanida y todos los lentes estaban hechos de hidrogel de silicona. Los criterios de diagnóstico de síntomas alérgicos incluyen usuarios de LC suaves que tienen síntomas de picazón en los ojos más al menos uno de los siguientes síntomas durante el uso de los LC: hiperemia conjuntival, secreción ocular, sensación de cuerpo extraño o malestar ocular. Los sujetos sanos se definieron como portadores de LC suaves que no tenían ninguno de los síntomas mencionados de forma previa. Se excluyeron las personas a las que se les administró algún medicamento tópico de agentes antialérgicos y/o agentes antimicrobianos dentro de los 3 meses anteriores al inicio del presente estudio. Se excluyeron las personas diagnosticadas con ojo seco o dermatitis atópica.
Aislamiento de bacterias contaminadas de la solución para el cuidado de lentes de contacto. Las soluciones de cuidado de los LC que quedan en los estuches de almacenamiento de los LC se recogieron dentro de las 4 horas posteriores al uso de los LC en el mismo día. Se tomaron muestras de la solución (0.1 ml) y se extendieron sobre una placa de agar de infusión de cerebro-corazón (BHI; Eiken Chemical Co., Ltd.). La placa se incubó a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas en la placa se inocularon de manera individual en el caldo BHI. El cultivo se centrifugó (10,000 x g, 5 min, 4°C), se lavó una vez con buffer ácido tris-etilendiaminotetraacético (TE) [10 mM Tris-HLC (pH 8,0), ácido etilendiaminotetraacético 1 mM] y se resuspendió en 0.5 ml de buffer TE. Al utilizar una parte de la suspensión, se realizó la tinción de Gram. Después de hervir las muestras, se centrifugaron (10,000 x g, 5 min, 4˚C), y los sobrenadantes se utilizaron como plantillas para la amplificación del DNAr 16S se utilizaron cebadores universales 27F (5'‑ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ‑ 3 ') y 1492R (5'‑ GGM TAC CTT GTT ACG ACT T-3 '). La identificación de especies se realizó mediante una búsqueda BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) de las secuencias de ADNr 16S obtenidas frente a la base de datos de ARN ribosómico 16S en NCBI. La especie de cada colonia se identificó como el microorganismo más afectado (>97% de identidad) mediante una búsqueda BLAST.
Cuantificación de histamina mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR). Se recolectaron fluidos lagrimales de los sujetos del estudio mientras usaban los LC al mismo tiempo que se recolectaron sus soluciones de cuidado de los LC, se sumergieron en la prueba de papel de Schirmer (Eagle Vision) y se destilaron en buffer de fosfato salino (PBS). Un experimento adicional que usó solución salina para medir la cantidad de fluidos lagrimales por 1 mm de la prueba de papel de Schirmer reveló que el papel se empapó con aproximadamente 0.5 μl de fluidos por 1 mm (Tabla SI). Por lo tanto, la cantidad de líquido lagrimal recolectada de los sujetos fue aproximadamente 5 μl, ya que se recolectaron cuando la escala de la prueba de papel de Schirmer alcanzó los 10 mm. Para 8 sujetos con una escala de empapada de lágrimas de ≥15 mm en la prueba de papel de Schirmer, se utilizaron 0.5 μl de los fluidos lagrimales para el análisis de inmunotransferencia tipo Western como se describe a continuación. Los fluidos lagrimales de los sujetos con síntomas alérgicos se recolectaron durante el período sintomático. Cada líquido lagrimal diluido (0.1 ml) se mezcló con 0.3 ml de HLCO4 0,6 M. Después de agitar con vórtex, la mezcla se centrifugó durante 15 minutos a 10.000 x g. El sobrenadante se filtró a través una membrana de 0.2 μm. Para la derivatización se utilizó una alícuota de 80 µl del extracto. Las muestras de extracto que contienen 0.8 μg/ml de 1,7-diaminoheptano como patrón interno se dansilaron como describieron con anterioridad Chiacchierini et al. La concentración de histamina dansilada se determinó por CLAR. La CLAR se realizó con un sistema de CLAR Tosoh 8020 equipado con una bomba CC PM ‑ II, un detector de longitud de onda variable UV ‑ 8020, un horno de columna CO ‑ 8020 y un desgasificador en línea Degasys DG ‑ 1210 (Uniflows Co., Ltd.). El área de pico cromatográfico se calculó con un grabador cromatográfico SIC (System Instruments Co., Ltd.). La separación se realizó en una columna TSKgel ODS-80Tm de fase inversa (4,6x150 mm, Tosoh Corporación). La temperatura de la columna se mantuvo a 25ºC y la absorbancia se controló a 254 nm. Los 50 µl de cada una de las muestras se inyectaron en la columna y se eluyeron a un caudal de 1.2 ml / min. La fase móvil fue acetonitrilo-H2O (60:40, v/v). El clorhidrato de histamina (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) se utilizó como un estándar.
Análisis del microbioma. Se centrifugaron los fluidos lagrimales y las soluciones para el cuidado de los LC (10.000 x g, 5 min, 4ºC) y los sedimentos se lavaron una vez con buffer TE (pH 8.0). Después de la centrifugación (10,000 x g, 5 min, 4˚C), los gránulos se congelaron a -80˚C hasta su uso. La extracción de ADN se realizó según el método reportado de forma previa por Morita et al. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon amplificando la región V3-V4 del rDNA 16S con los cebadores (5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG ‑ 3 ' y 5'‑ TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG ‑ 3 'y 5'‑ GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ') descrito de forma previa por Klindworth et al. Después de la amplificación inicial, se realizó una segunda reacción en cadena de la polimerasa con el kit Nextra XT Index (cat. No. 15055294, Illumina, Inc.) para conectar adaptadores Illumina, así como códigos de barras que permiten la multiplexación. La amplificación se realizó en reacciones de 25 μl que contenían 2.5 μl de plantilla diluida, 12.5 μl de 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix (no. de cat. KK2602, Kapa Biosystems) y 5 µl de cada uno de los cebadores. El ciclo térmico consistió en un paso de desnaturalización inicial (3 min a 95°C), seguido de 25 ciclos de desnaturalización (30 segundos a 95°C), recocido (30 segundos a 55°C) y 30 segundos de extensión a 72˚C. La extensión final se realizó durante 5 min a 72˚C.
Los amplicones se purificaron con perlas AMPure XP (nº de cat. A63881, Beckman Coulter, Inc.). La integridad de la biblioteca de amplicones de ADN se evaluó mediante un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Japan, Ltd.) con un Kit de ADN de alta sensibilidad de Agilent (n. ° de catálogo 5067‑4626, Agilent Technologies Japan, Ltd.). La concentración de carga de ADN se ajustó a 6 pM cada uno con el fluorómetro Qubit Q32857 (Thermo Fisher Scientific K.K.) con un Qubit dsDNA BR Kit de ensayo (nº de catálogo Q32853, Thermo Fisher Scientific K.K.). La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina MiSeq (no. de cat. MS ‑ 102‑3003, kit de reactivos MiSeq versión 3.600 ciclos, Illumina, Inc.) según las especificaciones del fabricante para generar lecturas de extremo emparejado de 300 bases en longitud en cada dirección. En total, se obtuvieron 15.992.047 lecturas de 2x300 pares de bases con un promedio de 333.168 lecturas por muestra. Las secuencias de cebadores se recortaron y las lecturas del extremo emparejado se combinaron al usar fastq-join con los parámetros predeterminados y procesado con el proceso QIIME 1.8.0. Se siguió un chequeo de quimera por Usearch v6.1.544, se seleccionaron al azar 20,000 lecturas de Illumina por muestra (Phred promedio >20) para un análisis adicional. Con el algoritmo ULCUST integrado en el proceso QIIME, las secuencias se agruparon a 97% de identidad contra la base de datos de referencia de Greengenes (http://greengenes.lbl.gov), al producir 744 unidades taxonómicas operativas (UTO). Al usar el proceso QIIME, se produjeron y utilizaron distancias UniFrac no ponderadas para la investigación de la diversidad beta mediante el trazado de coordenadas de análisis de coordenadas principales (ACP). El proceso de análisis QIIME que incluye este programa se descargado por medio de QIIME (http://qiime.org/).
Análisis de Western blot contra bacterias oculares mediante IgE lagrimal. Staphylococcus aureus 209P, Staphylococcus epidermidis (aislado de la solución de cuidado de LC del sujeto 9), Staphylococcus capitis (aislado del líquido lagrimal del sujeto 15), Streptococcus pneumoniae IID555 y Streptococcus tigurinus (aislados de la solución de cuidado de LC del sujeto 1) se cultivaron en condiciones microaerofílicas (5% CO2) en BHI a 37°C durante 24 horas. Las células bacterianas se centrifugaron (10,000 x g, 5 min, 4°C), se lavó una vez con PBS y se resuspendió en 4% paraformaldehído en PBS (PFA) hasta DO600 = 1,0. Los sobrenadantes del cultivo se mezclaron con PFA a 1: 1. Los 2 μl cada uno de la suspensión de células bacterianas, los sobrenadantes de cultivo o la IgE humana purificada (H + L; 1,0 μg / ml, nº de cat. ab65866, Abcam) se trazaron en una membrana de nitrocelulosa y se secaron durante la noche a 25˚C. El bloqueo se realizó con leche desnatada al 3% en PBS con Tween-20 (PBS-T) durante 1 hora a 25˚C. La membrana se lavó 3 veces con PBS-T. La membrana se incubó con fluidos lagrimales diluidos (10 μl cada uno) en 3 ml de PBS-T a 30°C durante 1 hora. Después de lavar 3 veces con PBS-T, el anticuerpo de cabra anti-IgE humana (H + L) HRP-conjugado (1: 1,000) (cat. No. Ab73901, Abcam) se añadió y se incubó a 30ºC durante 1 hora con agitación suave. La membrana se lavó 3 veces con PBS-T, y la señal de quimioluminiscencia desarrollada por ELC Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare UK Ltd.) se detectó con LAS4000 (GE Healthcare UK Ltd.). Para examinar la unión no específica de la IgE a las células bacterianas, se utilizó IgE humana (1,0 μg/ml) en lugar de líquidos lagrimales. Se aplicó hibridación Western dot-blot a 6 sujetos con AS y 2 sujetos sanos que pudieron recolectar suficientes fluidos lagrimales para el examen.
Análisis estadístico. El tamaño mínimo de muestra requerido para el presente estudio se calculó con Easy R (EZR) versión 1.41 (21). Medidas microbiológicas cuantitativas se transformaron a log10 antes de realizar un análisis. Todos los experimentos se realizaron al menos 3 veces. Los datos se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrada, análisis de varianza unidireccional y la prueba post hoc de Tukey (StatFlex ver.6, Artec Co., Ltd., Tokio, Japón) para evaluar la importancia. Los valores de p < 0.05 se consideraron para indicar diferencias de forma estadística significativas.
Depósito de secuencia de datos. Se depositaron los datos de la secuencia en la base de datos DDBJ (números de acceso DRA010383: https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/submission?acc=DRA010383; PRJDB10068: https://ddbj.nig.ac.jp/BPSearch/bioproject? acc=PRJDB10068; SAMD00232908‑SAMD00232922:
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX224997,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX224998,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX224999,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225000,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225001,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225002,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225003,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225004,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225005,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225006,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225007,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225008,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225009,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225010,
https://ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/experiment?acc=DRX225011).
Resultados
La recolección de muestras, el aislamiento de bacterias y el nivel de histamina en fluidos lagrimales. Los fluidos lagrimales y las soluciones para el cuidado de los LC que quedan en los estuches de almacenamiento de lentes se obtuvieron de 15 usuarios de LC (9 sujetos con SA y 6 sujetos sanos) (Tabla I). Los cultivos bacterianos de las soluciones de cuidado de los LC fueron positivos en 5 de los 9 sujetos con AS y en 2 de los 6 sujetos sanos, y se detectaron diversas bacterias. Las tasas de cultivo positivo entre las soluciones de cuidado de lentes de contacto de los sujetos con SA y los sujetos sanos no exhibieron ninguna diferencia significativa de forma estadística (P = 0.3980, datos no mostrados). Todos los cultivos de lágrimas fueron negativos excepto 1 participante (sujeto 15) de quien se aisló Staphylococcus capitis. El número total de bacterias en las soluciones de cuidado de los LC con cultivo positivo no difirió de forma significativa entre los sujetos con SA y sujetos sanos (log10 UFC/ml, 2.82 ± 1.89 vs.4.95 ± 1.09, P = 0.2086, datos no mostrados). Se detectó histamina en 2 sujetos con SA (sujeto 2, 0.032 μg/ml; sujeto 7, 0.223 μg/ml).
Análisis del microbioma de la solución de cuidado de los LC. Las composiciones bacterianas de las soluciones de cuidado de los LC se evaluaron mediante secuenciación de Illumina rDNA 16S (Tabla SII). Se detectaron diversas bacterias en las soluciones de cuidado de los LC incluso en las muestras con cultivo negativo. Una búsqueda BLAST contra la base de datos de Greengenes identificó 98‑304 UTOs/muestra. Como se muestra en la Figura 1A, se observaron 3 patrones de contaminación en las soluciones de cuidado de los LC de los sujetos con SA por ACP. El grupo LC-I (sujetos 2, 7, 8 y 9) exhibió patrones de contaminación muy similares, que de forma clara diferían de los de los sujetos sanos. Los grupos LC-II (sujetos 1 y 5) y LC-III (sujetos 3, 4 y 6) no se separaron de forma clara de los sujetos sanos. La abundancia de bacterias grampositivas en el microbioma de las soluciones de cuidado de los LC utilizadas por el grupo LC-I fue mayor que la del grupo de sujetos sanos (42.24 ± 9.47% frente a 16.85 ± 22.76% de abundancia) (Cuadro SII). La Fig. 1B muestra los géneros bacterianos representativos con >5% de abundancia en cada solución de cuidado de LC. Las soluciones para el cuidado de LC del grupo LC-I contenían Streptococcus de forma exclusiva (mostrado en magenta) como miembro dominante de los contaminantes (12.1-18.3% de abundancia). El porcentaje total de UTO con >5% de abundancia en el grupo LC-I fue menor (<65%) que en los otros sujetos (>70%), aunque el número de UTO observado fue alto de manera relativa (165‑210). Estos hallazgos indican que las soluciones de cuidado LC del grupo LC-I contenían una población menos diversa de bacterias. En consecuencia, el índice de Shannon-Weaver calculado a partir de la abundancia a nivel de género fue más alto en el grupo LC-I (10.70 ± 1,14) que en los otros sujetos con SA (5.19 ± 2,36) o sanos (5.00 ± 1.33) (P < 0.01 (Figura 1C).
Análisis del microbioma del líquido lagrimal. Se examinó la composición microbiana en el líquido lagrimal de los sujetos con SA y de los sujetos sanos (Tabla SIII). El líquido lagrimal del sujeto 1 se excluyó del análisis debido a su volumen pequeño. Se detectaron un total de 36-177 UTOs/muestra. Es de destacar que el análisis del microbioma lagrimal reveló tendencias similares a las de la solución de cuidado de los LC. Como se muestra en el gráfico de ACP, los fluidos lagrimales de los sujetos con SA se separaron de forma clara en grupos que se asemejan a los patrones del microbioma en las soluciones de cuidado de los LC (Fig. 2A). Los géneros bacterianos representativos con >5% de abundancia en cada líquido lagrimal se muestran en la Fig. 2B. El porcentaje total de UTO con >5% de abundancia en el grupo LC-I fue menor (<50%) que en otros sujetos (>50%); sin embargo, el número observado de UTO fue alto de manera relativa (91-132). Estos resultados indicaron que la diversidad bacteriana en los fluidos lagrimales del grupo LC-I fue más alta que la de los otros sujetos. Aunque se detectó Streptococcus en todos los fluidos lagrimales, excepto en el sujeto 5, su abundancia en el grupo LC-I fue mayor de forma significativa que en los otros sujetos (19.02 ± 5.50 vs 3.08 ± 3.35%, P < 0.01). Para comparar las composiciones microbianas en las soluciones para el cuidado de los LC y los fluidos lagrimales, las secuencias obtenidas de Illumina de ambos tipos de muestras se fusionaron y se realizó ACP (Figura 2C). Aunque las gráficas de ACP se separaron de forma clara según el tipo de muestra, las gráficas que denotaban muestras de solución para el cuidado de lentes de contacto y las lágrimas del grupo LC-I estaban cerca de entre sí, en comparación con la distancia entre las gráficas que denotan las muestras de solución para el cuidado de los LC y las lágrimas en sujetos distintos al grupo LC-I. Esto se debió a la gran abundancia de Streptococcus en ambos tipos de muestras del grupo LC-I.
Detección de IgE lagrimal que reacciona con cocos grampositivos. La disposición de los antígenos bacterianos se presenta en la Fig. 3A. Como se muestra en la Fig. 3B, se detectó unión de IgE a la suspensión de células bacterianas de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus tigurinus en los fluidos lagrimales de 6 sujetos con SA (100%) así como en 2 sujetos sanos (100%). La unión de IgE a especies de Staphylococcus no estuvo presente excepto para el sujeto 11, en el que la IgE reaccionó de forma débil con células concentradas de Staphylococcus aureus. No se detectó señal cuando los sobrenadantes de cultivo se utilizaron como antígenos. De manera interesante, la IgE del suero humano reaccionó de forma débil con las células de Streptococcus tigurinus.
Discusión
Varios estudios reportaron que los lentes de contacto y los accesorios para el cuidado se contaminan con microorganismos no sólo en pacientes con queratitis infecciosa, sino también en usuarios asintomáticos de LC. El cultivo de muestras identificó los microorganismos contaminantes en los accesorios para el cuidado de los LC, y los microorganismos aislados con mayor frecuencia son bacterias. Entre los accesorios para el cuidado de los LC, el estuche de almacenamiento de lentes es el más contaminado y hay reportes de que la tasa de contaminación supera 80%. Se considera que los estuches de almacenamiento de lentes se contaminan de forma rápida, seguido de la contaminación que se propaga al LC y botellas de solución de cuidado. Shin et al analizaron el microbioma de la superficie ocular de los usuarios de LC, utilizaron tecnología SPG y reportaron que el uso de LC altera el microbioma. Al considerar la posibilidad de que la fuente de contaminación por LC es el estuche de almacenamiento de lentes, es razonable analizar el microbioma de la solución de cuidado LC en el estuche de almacenamiento de lentes para identificar las bacterias que migran a la superficie ocular por el uso de lentes de contacto.
En términos de la comparación de los sujetos con SA y los sujetos sanos, el presente estudio investigó primero tanto las soluciones de cuidado de lentes de contacto en los estuches de almacenamiento de lentes como los fluidos lagrimales de los usuarios de LC por cultivo. Se encontró que la tasa de cultivo positivo de las soluciones para el cuidado de LC y el número de bacterias contaminantes no difirieron de forma significativa entre los sujetos con SA y los sujetos sanos. Como se reportó con anterioridad por Tagliaferri et al, este resultado sugiere que las soluciones para el cuidado de lentes de contacto de los sujetos con SA no siempre están más contaminadas por bacterias cultivables que las de los sujetos sanos. Según varios artículos que investigaron la contaminación bacteriana en los estuches de almacenamiento de lentes, las especies de Staphylococcus, las especies de Serratia y las especies de Pseudomonas se aíslan con frecuencia.
El presente estudio también aisló principalmente Pseudomonas sp., Microbacterium sp. y Staphylococcus sp. (Tabla I). Las fuentes de contaminación se consideran dedos, párpados y ambientes acuosos cerca de las cajas de almacenamiento. Sin embargo, hay una serie de bacterias exigentes en el medio ambiente y el porcentaje de bacterias que se pueden crecer en cultivo es sólo 1%. También se debe prestar atención al hecho de que el cultivo sólo puede detectar bacterias viables. No sólo las bacterias viables, sino también las bacterias muertas que se acumulan en el estuche de almacenamiento de la lente pueden involucrarse en el inicio de la conjuntivitis alérgica. Por lo tanto, el análisis metagenómico es más ventajoso para investigar el microbioma de los estuches de almacenamiento de los lentes que el cultivo convencional. Con respecto a los cultivos de muestras de lágrimas, el aislamiento bacteriano falló para todos menos uno de los sujetos. Es razonable suponer que algunos unos pocos microlitros del líquido lagrimal contienen sólo una cantidad mínima de bacterias, ya que el líquido lagrimal desempeña un papel en la autolimpieza de la superficie ocular mediante el flujo. Dado que aumenta la probabilidad de detección al amplificar el ADN incluso en una muestra que contiene una cantidad pequeña de bacterias, es probable que el análisis genómico sea más útil que el cultivo.
Como resultado del presente estudio del microbioma en soluciones de cuidado de LC y fluidos lagrimales al utilizar técnicas de SPG, se encontró que las bacterias contenidas en las soluciones de cuidado de LC y los fluidos lagrimales eran más diversas que las detectadas por cultivo (Tablas SII y SIII). El uso de lentes de contacto puede afectar el microbioma del líquido lagrimal al hacer circular las soluciones de cuidado entre la superficie ocular y la caja de almacenamiento, lo que se apoya en el hecho de que el microbioma de los líquidos lagrimales en sujetos con síntomas alérgicos se dividió en 3 grupos, similar al de las soluciones para el cuidado de lentes de contacto (Fig. 2A).
Se planteó la hipótesis de que el patrón de contaminación de la solución de cuidado de LC en cada caso varía según las diferencias ambientales individuales. De hecho, el microbioma de la solución para el cuidado de LC no mostró un patrón de contaminación específico en sujetos sanos en este estudio (Fig. 1A). ACP reveló que el grupo LC-I en los sujetos con SA se distinguía de los sujetos sanos (Figs. 1A y 2A) y se elevó la concentración de histamina en los fluidos lagrimales de los 2 sujetos agrupados en el grupo LC-I (Tabla I). Se encontró que las soluciones para el cuidado de LC y los fluidos lagrimales del grupo LC-I se contaminaron con una población diferente de bacterias en comparación con otros sujetos (Figs. 1B, C y 2B). En particular, la proporción de los Streptococcus fue más alta de forma significativa (Figs. 1B y 2B), lo que sugiere la posible participación del Streptococcus en la etiología de al menos ciertos subtipos de síntomas alérgicos asociados a los LC. Por el contrario, en los grupos LC-II y LC-III no hubo diferencia en el microbioma de las soluciones de cuidado de los LC de los sujetos sanos; por lo tanto, otros factores además del cambio en el microbioma de las soluciones para el cuidado de LC quizá se relacionen con síntomas alérgicos en los grupos LC-II y III. De manera alternativa, la falta de una elevación en la concentración de histamina en los fluidos lagrimales de sujetos en los grupos LC-II y III sugiere que los síntomas en estos sujetos no se causaron por una respuesta alérgica. Los pacientes con trastornos corneales y/o conjuntivales pueden experimentar picazón incluso sin una conjuntivitis alérgica. La división de sujetos con SA en 3 grupos de acuerdo con sus patrones de trazado de ACP de microbioma pudo ocurrir ya que la enfermedad que causó picazón en cada grupo fue diferente. Sin embargo, queda por dilucidar si el microbioma de la superficie ocular diferiría en función de la enfermedad que causa la picazón. Aunque se excluyeron los casos de ojo seco y dermatitis atópica, no se puede especificar la causa de los síntomas en sujetos pertenecientes a los grupos LC-II y III, ya que no se diferenciaron todas las demás enfermedades que pueden inducir SA. Por lo tanto, no se puede especificar la razón de los 3 patrones diferentes de trazado de ACP del microbioma en el presente estudio.
La IgE es un mediador químico importante en las enfermedades alérgicas. Se considera que la CPLC, la conjuntivitis alérgica asociada con el uso de lentes de contacto se relaciona con las alergias de tipo I y IV. Los estudios reportaron que la IgE de la superficie ocular de los pacientes con CPLC aumentó de forma significativa, en comparación con la de los usuarios de LC sanos, debido a la participación de la alergia tipo I. Sin embargo, Zhao et al examinaron sólo la IgE total eluida de la lente de contacto y no examinaron la IgE específica a alérgenos; por tanto, no se aclaró el antígeno. Barishak y colegas examinaron la IgE específica al antígeno en los fluidos lagrimales de pacientes con CPLC con una prueba radioalergosorbente, y detectaron IgE contra los ácaros del polvo doméstico y el epitelio del gato sólo en uno de esos pacientes. En el presente estudio, se utilizó el método de Western dot blotting para identificar IgE específica a bacterias en los fluidos lagrimales de los sujetos. En vista de los resultados de que se detectaron varias bacterias grampositivas, en particular Firmicutes en el microbioma (Tablas SII y SIII), se examinó la reactividad de la IgE lagrimal contra Streptococcus y Staphylococcus. Se detectó IgE contra Streptococcus en el líquido lagrimal no sólo de sujetos con SA, sino también de sujetos sanos (Fig. 3B), y la IgE sérica humana también respondió a Streptococcus, lo que sugiere que Streptococcus puede tener una fuerte influencia en el sistema inmunológico humano. Bisgaard et al informaron que la colonización de Streptococcus pneumoniae en la hipofaringe durante el período neonatal se involucró en el desarrollo del asma pediátrica. También hay un estudio que reporta que la tasa de colonización de Streptococcus pneumoniae en la orofaringe es más alta en pacientes con asma que en sujetos sanos. La investigación publicada en los últimos años que examina el microbioma de las vías respiratorias mediante el análisis de ADNr 16S reveló que la colonización asintomática temprana con Streptococcus es un fuerte predictor de asma y la presencia de Streptococcus sp se relaciona con el asma grave. La infección previa de la faringe con Streptococcus se involucra en la aparición y la exacerbación de la psoriasis, una enfermedad autoinmune de la piel. La estructura molecular de la proteína M de los estreptococos y la proteína de queratinocitos es similar, por lo que se considera que las células T específicas a estreptococos causan una reactivación cruzada con autoantígenos epidérmicos. Esto sugiere que el Streptococcus se involucra en el desarrollo y progresión de varias enfermedades inmunes, y posiblemente desempeña un papel igual de importante en los síntomas alérgicos.
En el presente estudio, se evaluó la respuesta de IgE lagrimal a Streptococcus pneumoniae y Streptococcus tigurinus, ambos pertenecientes al grupo mitis del estreptococos (Fig. S1). Dado que la IgE no reaccionó con el sobrenadante del cultivo, sino con las células bacterianas en el presente estudio, parece reaccionar con antígenos comunes del grupo mitis de estreptococos que se expresan en la superficie bacteriana pero no con una sustancia producida y secretada por Estreptococo. Dado que la IgE que reacciona a los antígenos estreptocócicos está presente en los fluidos lagrimales de una gama amplia de individuos, la exposición repetida al grupo mitis de estreptococos puede provocar SA en ciertas poblaciones.
Existen varias limitaciones para el presente estudio. Primero, el tamaño de la muestra fue pequeño. Se reclutó a pacientes que no sufrieron mucho por el uso de lentes de contacto en su vida diaria. Por lo tanto, fue difícil recolectar una gran cantidad de candidatos sin ofrecer incentivos. Como consecuencia, hubo una marcada diferencia de sexos, con 12 mujeres y 3 hombres. Aunque hay varios reportes de que no hay diferencias de sexo con respecto a la tasa de contaminación de accesorios para el cuidado de LC, una proporción sesgada de sexos aún puede ser un factor de confusión en el análisis actual del microbioma. La CPLC es más común en usuarios de LC a largo plazo. Sin embargo, en el presente estudio, todos los sujetos estaban en su adolescencia o principios de los 20, y usaron LC durante <5 años; por lo tanto, la CPLC fue leve en todos los sujetos. Si se realizara un estudio similar del microbioma que dividiera un gran número de sujetos según la experiencia de uso de lentes de contacto a corto y largo plazo, quizá se obtengan nuevos hallazgos. Aunque el tamaño de la muestra fue tolerable en el presente estudio, un tamaño de muestra mayor sería aún más confiable. En segundo lugar, la picazón también puede ocurrir en enfermedades oculares distintas a las alergias. Por tanto, los resultados del presente estudio no sugieren que el Streptococcus spp. se asocie con enfermedades oculares alérgicas, sólo que se asocia con sus síntomas. En tercer lugar, como los antígenos no se examinaron de forma exhaustiva, existe la posibilidad de que pueda haber un antígeno relacionado con los SA distinto del Streptococcus, como ciertos aeroalérgenos. En cuarto lugar, a partir de los resultados del presente estudio, no se pudo determinar si los síntomas alérgicos se desarrollaron debido a la proporción alta de Streptococcus en la solución de cuidado de los LC y el microbioma lagrimal o si la alteración del microbioma después del desarrollo de la alergia resultó en la proporción alta de Streptococcus en estas muestras. Por último, en las muestras con un volumen bacteriano bajo, los resultados se pueden afectar por la contaminación que puede ocurrir en todos los pasos desde la recolección de las muestras hasta la manipulación del ADN, aunque es imposible evitar por completo la contaminación bacteriana de todos los procesos experimentales. Si el proceso experimental es igual en todas las muestras, se esperaría que el nivel de contaminación fuera el mismo. Son necesarios más estudios con gran número de sujetos con conjuntivitis alérgica, diagnosticados por medición de IgE sérica y raspado conjuntival para detectar eosinófilos y sin contaminación bacteriana del microbioma de la superficie ocular para resolver estas limitaciones. El ACP con un tamaño mayor de la muestra puede proporcionar nuevas tendencias para las especies involucradas en la conjuntivitis alérgica. Si puede confirmarse la presencia de IgE específica, en lágrimas y suero, para esa especie, entonces puede ser posible la identificación de los implicados en la conjuntivitis alérgica.
En conclusión, en el presente estudio, las soluciones para el cuidado de LC que permanecieron en los estuches de almacenamiento de lentes y los fluidos lagrimales de algunos usuarios de LC que padecen SA exhibieron un nivel relativo más alto de forma significativa de estreptococos y la IgE que reaccionó a los antígenos estaba presente en los fluidos lagrimales. Esto sugiere una asociación entre la contaminación por Streptococcus de la caja de almacenamiento de la lente y los síntomas alérgicos asociados con el uso de lentes de contacto. Sin embargo, se requieren más estudios para determinar uno de los verdaderos antígenos de los síntomas alérgicos asociado con el uso de lentes de contacto.
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC
Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL
Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. med. Carmen Zárate Hernández Profesor
Dra. Grecia Jaqueline Hernández Salcido Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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