INTRODUCCIÓN
La dermatitis atópica (DA) se reconoce cada vez más asociada con un riesgo mayor de comorbilidad cardiovascular, debido de manera probable a inflamación sistémica persistente. En la actualidad se llevan a cabo esfuerzos para desarrollar biomarcadores de DA invasivos de forma mínima. Estudios proteómicos en sangre con el ensayo OLINK Multiplex (que requiere sólo 10 mcL de suero) identifican biomarcadores que reflejan la gravedad de la DA y las medidas de la barrera funcional, y destacan la activación inmune sistémica en la DA adulta e incluso en la pediátrica de inicio temprano.
Sin embargo, la comprensión molecular de los mecanismos patológicos de la DA se basa de forma principal en estudios de la piel. Hace falta un estudio proteómico completo en la piel, con correlaciones apropiadas con niveles en sangre. Se realizaron dos estudios proteómicos cutáneos en DA, que utilizan tiras de cinta para evaluar un panel limitado de mediadores inflamatorios en el estrato córneo en niños con DA. Además, algunos biomarcadores característicos de DA (por ejemplo, IL-4 e IL-13), que de forma típica se encuentran muy elevados en piel completa con firmas genómicas de DA, no se detectaron o mostraron disminución de la expresión en estos estudios de cintas de tira. Hace falta el perfil proteómico completo de biopsias de piel completa en la DA comparado con controles.
Este estudio es el primero, en el conocimiento del autor, en caracterizar el perfil proteómico de la piel lesionada y no lesionada de pacientes adultos con DA de moderada a grave, al utilizar un panel grande de 354 marcadores medidos con la plataforma OLINK de alto rendimiento.
MÉTODOS
Pacientes
Se reclutaron 20 adultos (9 mujeres, 11 hombres) con DA moderada a grave. Los pacientes tuvieron una edad media de 40.6 años, el promedio del puntaje SCORAD fue 61.8 y el promedio de la puntuación del Índice del Área y Gravedad del Eccema (EASI) fue 27.4. El grupo control saludable se compuso por 28 individuos (13 mujeres, 15 hombres) con una edad media de 37 años.
Los pacientes no usaron tratamientos tópicos (corticoesteroides, antagonistas de la calcineurina o crisaborole) por ³2 semanas, y fototerapia o tratamiento sistémico, como dupilumab u otros medicamentos en investigación, por ³4 semanas antes del reclutamiento. No hubo diferencias significativas demográficas entre pacientes y controles. Los pacientes y los controles no reportaron comorbilidades cardiovasculares, y los controles sanos no tenían afecciones atópicas. Los pacientes tenían DA crónica desde la infancia. Las puntuaciones de gravedad incluyeron SCORAD y EASI.
Recolección de muestras de biopsia
Se obtuvieron biopsias de lesiones de DA, áreas libres de lesión de DA y piel sana bajo protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional. Las biopsias de piel no lesionada se obtuvieron de la vecindad de las lesiones, pero a ³10 cm de distancia de las lesiones activas. Los sitios biopsiados no mostraron evidencia de infecciones. La mayoría de las muestras de biopsia en pacientes y controles se tomaron de las extremidades (debido a que la DA afecta de forma más común a los pliegues) y sólo si no fue posible, del tronco.
Cuantificación de proteínas cutáneas y sanguíneas
Las muestras de biopsia de piel se incluyeron en el compuesto Tissue-Tek de Temperatura Óptima de Corte (Sakura Finetek USA, Torrance, CA), se molieron y se centrifugaron. Luego, se usaron 10 mcg de proteína para la plataforma ultrasensible multiplex Olink Proseek con 4 paneles: inflamación, enfermedad cardiovascular (ECV) II, ECV III y neuroinflamación (354 marcadores establecidos y exploratorios), como se reportó.
Se colectó sangre de los mismos participantes en el estudio y se analizaron 10 mcL de suero, se usaron los mismos paneles de Olink, como se describió.
Análisis de expresión génica con secuenciación de ARN
Se extrajo el ARN de las mismas muestras de biopsia y la secuenciación del ARN (ARNseq) se realizó con Illumina HiSeq4000 (Illumina, San Diego, CA), como se describió.
Análisis estadístico
El análisis se realizó con el lenguaje R (R-project.org) y los paquetes del Proyecto Bioconductor (bioconductor.org), como se describió.
Los perfiles de proteínas y la expresión génica se modelaron mediante modelos lineales con el marco de R limma. Los valores de P de las pruebas t moderadas (emparejadas) se ajustaron para múltiples hipótesis con el procedimiento de Benjamini-Hochberg para producir tasas falsas de descubrimiento (TFD). Las proteínas con cambios (PCP) >2.0 y las TFD <0.05 se consideraron expresadas de manera diferencial.
Un subconjunto de 21 proteínas relacionadas con la transmisión de señales de la aterosclerosis, se cuantificaron al utilizar un análisis de variación del conjunto de genes (GSVA z-score). Las correlaciones entre el ARN mensajero (ARNm), las proteínas y los puntajes de gravedad en la piel y la sangre se evaluaron mediante correlaciones de Spearman.
RESULTADOS
El perfil proteómico de la piel con DA muestra aumento en las proteínas inflamatorias y proaterogénicas
El estudio incluyó a 20 adultos con DA moderada a grave y 28 controles sanos. La plataforma multiplex proteómica de alto rendimiento Olink evaluó 354 proteínas de los paneles de inflamación, ECV II, ECV III y neuroinmunología, piel con DA, lesionada y no lesionada, y piel de control. De las 354 proteínas, 161 se expresaron de manera diferencial (PCP >2 y TFD < 0.05) en piel con DA lesionada y 69 en piel con DA no lesionada en comparación con la piel control. Las 50 principales de estas 161 proteínas expresadas de manera diferencial (PED) en la piel con DA se presentan en un mapa de calor (Figura 1).
Se observaron elevaciones en los marcadores proteicos de las células inflamatorias, como las células dendríticas (ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral [TNFSF10/TRAIL]) y la activación de células T/células T (receptor alfa de la interleucina 2 [IL-2RA], CD40) tanto en piel con DA lesionada como no lesionada (TFD <0.05). También se observó aumento significativo de la expresión de las proteínas asociadas con inflamación general (metaloproteinasa de matriz [MPM] 12) y múltiples ejes inmunes, como las células T cooperadoras (Th)2 (IL-13, receptor tipo 1 [IL1RL1]/IL-33R de la IL-1, ligando [CCL] de la quimiocina [motivo CC] 13/CCL17), Th1 (ligando [CXCL] de la quimiocina motivo CXC 9/CXCL10) y Th17/Th22 (PI3, CCL20, S100A12) en piel con DA no lesionada o lesionada (TFD <0.05), o ambos, en comparación con los controles.
Las principales proteínas con mayor expresión en la piel con DA con lesiones o sin lesiones, o ambas, comparadas con controles incluyeron múltiples dianas proteicas pronósticas y terapéuticas de riesgo de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular (Fig. 1, Tabla Suplementaria I).. Estas incluyeron biomarcadores potenciales u objetivos terapéuticos de la aterosclerosis, como E-selectina (ESEL), metaloproteinasas de matriz (MPM) (MPM1, MPM3 y MPM9), CCL19, CCL2, resistina (RETN), factor de crecimiento de plaquetas (FCP), receptor 1 de la lipoproteína de baja densidad oxidizada tipo lectina (LOX-1) (u ORL1), mieloperoxidasa (MPO), y proteína 4 de unión a ácidos grasos (PUAG4) (TFD <0.05). También se encontró aumento significativo en las citocinas y los receptores innatos (IL-6R, IL-8; TFD <0.05) que promueven la aterosclerosis. El factor de crecimiento transformante (TGF)-β1, involucrado en la hipertrofia cardíaca, la remodelación vascular y la regulación de la renina-angiotensina, el factor de crecimiento endotelial vascular A (FCEVA), que media la angiogénesis, y la hemo oxigenasa 1 (HMOX1), que protege contra la aterosclerosis, y el objetivo proapoptótico y potencial de insuficiencia cardíaca, caspasa-3 (CASP3), presentaron mayor expresión en piel no lesionada o lesionada, o en ambas (TFD < 0.05).
De manera inesperada, la piel no lesionada de los pacientes con DA demostró aumento significativo de la expresión de las proteínas asociadas con inflamación y aterosclerosis/riesgo cardiovascular en comparación con una piel sana (menor que en la piel lesionada), lo que enfatiza la naturaleza sistémica de la DA. Esto se enfatiza mediante el análisis de la variación del conjunto de genes de 21 proteínas específicas de transmisión de señales de aterosclerosis, que muestra aumento significativo de expresión de este subconjunto, tanto en la piel con DA lesionada y no lesionada versus la piel control (P <.05).
Para determinar si los pacientes con DA y otras afecciones atópicas tienen una firma diferente y quizás más inflamatoria que los pacientes con solo DA, también se realizó un análisis de sensibilidad que comparó los 2 grupos. Este análisis de sensibilidad no mostró diferencias significativas entre los 2 grupos.
La piel con DA muestra expresiones mucho más altas que la sangre
Después se investigó si la piel o los compartimentos sanguíneos (vía el flujo sanguíneo a la piel) son la fuente del aumento de la expresión de las proteínas inflamatorias y las relacionadas con aterosclerosis/riesgo cardiovascular en la piel con DA, al evaluar la relación entre la piel y la proteómica de la sangre.
En general, las diferencias entre la piel con DA lesionada y la piel sana fueron mucho más grandes que las de DA y la sangre de control, como se observa por el destacado predominio de marcadores en el lado derecho del diagrama de dispersión. Las PCP en la piel lesionada fueron no solo más grandes sino también más significativas que en sangre. Si bien, se encontraron 161 PED en la piel lesionada, sólo 1 PED en sangre cumplió con los criterios PCP >2 y TFD <0.05, similar a los reportes anteriores. Con un criterio más flexible (PCP <1.3 y P < .05), sin tener en cuenta múltiples hipótesis, se detectaron 220 PED en la piel lesionada y 20 PED en la sangre de DA en comparación con los controles. De las 20 PED en sangre, 17 se superponen con las PED de la piel, lo que sugiere que, mientras que la proteómica de la piel captura la mayor parte de la firma de la sangre, esto no se mantiene en la dirección opuesta. Entre las 17 PED superpuestas se encontraron proteínas asociadas con las vías inmunes Th2 (CCL13/CCL17), Th1 (CXCL9/CXCL10) y Th17 (PI3, CCL20) (P < .05). La MPM12 e IL-1RN, que se unen a IL-1R e inhiben la transmisión de señales de IL-1a/b (que se asocia con enfermedad cardíaca y es objetivo en ensayos clínicos en la actualidad), también se regulan de manera diferencial tanto en la piel como en la sangre (P < .05).
Para comprender cómo se correlaciona la expresión de proteínas en la piel y la sangre, se realizó un análisis de correlación de Spearman. Las proteínas con correlaciones significativas piel-sangre fueron de forma principal aquellas relacionadas con el riesgo cardiovascular. Los marcadores de remodelación de tejidos (MPM3; r = 0.544), Th1 (CXCL11; r = 0.469), Th2 (CCL13; r = 0.472) y el marcador de quimioatracción linfoide (CCL19; r= 0.469) demostraron correlaciones significativas entre la sangre y la expresión de lesión; la adhesión de células endoteliales (ESEL; r = 0.618), la activación de células T (CD6, TREML2; r = 0.514, r = 0.547) y los productos relacionados con Th17 (CCL20; r = 0.644) se correlacionaron de forma significativa entre la piel no lesionada y la sangre (P < .05).
También se correlacionaron las expresiones de proteínas en la piel con la gravedad clínica (EASI y SCORAD). En la piel lesionada, y en particular en la piel no lesionada, se encontraron correlaciones significativas entre las expresiones de marcadores relacionados con riesgo cardiovascular/aterosclerosis y la gravedad de la enfermedad, incluidos IL-18 (r = 0.448, P < .05), enzima convertidora de angiotensina I, que cataliza la escisión de angiotensina y desempeña un papel en la regulación de la función cardiovascular y renal (r = 0.537, P < .05) en piel lesionada, y FCEVA (r = 0.519, P < .05) en piel no lesionada. En sangre, FABP4 (r = 0.475), sortilina (SORT1) (r = 0.552) y HMOX1 (r = 0.602), que median el metabolismo de los lípidos y se asocian con la aterosclerosis, se correlacionan de forma significativa con EASI (P < .05).
Integración de las medidas de expresión de proteínas y ARNm en la piel con DA
Dado que los mecanismos de DA se estudiaron en gran medida por medio de la transcriptómica, se evaluó la relación entre el proteoma cutáneo de la DA y la firma transcriptómica del gen con ARNseq en las mismas muestras de biopsia. Debido a que el ARNseq cubre muchos más genes, se limitó el análisis a 339 marcadores, superpuestos con las medidas de Olink.
En general, las diferencias de proteínas y ARNm entre DA versus piel sana se correlacionaron de forma significativa en piel lesionada (r = 0.410, P < .001, Fig. 4) y no lesionada (datos no mostrados). Los genes con mayor expresión de ARNm con frecuencia demostraron niveles elevados de proteínas concordantes, lo que indica la traducción local en proteínas. En la piel lesionada en comparación con los controles, 83 de los 339 genes aumentaron su expresión de manera diferencial en ARNseq, mientras que 160 de las 339 proteínas aumentaron su expresión en Olink. Cincuenta y nueve productos genéticos aumentaron su expresión de manera común (Tabla Suplementaria I). Los marcadores con aumentos paralelos de proteínas y ARNm en la piel lesionada o no lesionada incluyeron mediciones inflamatorias (IL-13, oncostatina-M [OSM]) y de riesgo cardiovascular/aterosclerosis como IL-6 y MPM, que también demostraron correlaciones significativas de proteínas y ARNm.
Varios marcadores relacionados con la aterosclerosis/riesgo cardiovascular mostraron expresiones mucho más altas de proteínas que las del ARNm en piel lesionada en comparación con el control. Estos incluyen SOD2, ESEL, MPO, FABP4, CCL2, HMOX1, la serina proteasa PRSS27 y la proteinasa 3, que tiene actividad proapoptótica y proinflamatoria y se asocia con insuficiencia cardíaca después de un infarto de miocardio. Algunos marcadores innatos (IL-8), relacionado con Th1 (CXCL9/CXCL10) y Th2 (CCL13) también demostraron mayores expresiones de proteínas. Por el contrario, se observaron ARNm superiores en comparación con las expresiones de proteínas en algunos productos, incluido el ligando 3 de tirosina cinasa relacionado con Fms (FLT3LG), que regula las células dendríticas, IL-6, IL-10, IL-20, IL-12/23p40, S100A12 y CCL3.
DISCUSIÓN
Hasta el momento, ésta es la primera evaluación de la firma proteómica de la piel lesionada y no lesionada en individuos con DA moderada a grave en comparación con individuos sanos. Dos estudios previos de proteómica en piel arrancada con cinta adhesiva de infantes y niños con DA evaluaron paneles limitados de 27 y 28 mediadores inflamatorios, de manera respectiva. Además, la técnica de arrancamiento de cinta se limita a la detección de biomarcadores presentes en la epidermis más externa. De hecho, los biomarcadores clave de DA (IL-4, IL-13), los cuales presentan expresión aumentada en los análisis transcriptómicos de muestras de biopsia de piel completa de DA, no se detectaron o mostraron una expresión menor de proteínas en DA en comparación con las tiras de cinta de control.
En congruencia con estudios de expresión génica (o transcriptoma) de la piel, que establecieron los mecanismos patológicos de la DA, este perfil proteómico de piel con DA captura el medio inflamatorio en la piel con DA, e incluye elevaciones significativas en los marcadores relacionados con las vías Th2 (IL-13, CCL17), Th22 (S100A12), Th1 (CXCL10) y Th17 (CCL20).
Entre las proteínas con mayor expresión en la DA tanto en piel lesionada como no lesionada, se encontraron aumentos en múltiples proteínas asociadas a la aterosclerosis, como CCL2, CCL19, ESEL, FCP, LOX-1/RLO1, FABP4, MPO, MPM, RETN, CASP3, TGF-β1 y FCEVA. CCL2 o proteína 1 quimioatrayente de monocitos (PCM-1), se libera de los macrófagos y las células endoteliales, y tiene mayor expresión en placas ateroscleróticas. Se demostró que la quimiocina organizadora linfoide, CCL19, tiene mayor expresión en placas ateroscleróticas. Los niveles de la molécula de adhesión celular endotelial, ESEL, se asociaron con enfermedad coronaria, FCP, un homólogo de FCEV, se relaciona con el pronóstico de la enfermedad coronaria, y los anticuerpos anti-FCP inhibieron las placas ateroscleróticas en ratones.
LOX-1/RLO1, participa en los pasos críticos de la aterosclerosis. Varios medicamentos antiateroscleróticos (estatinas, metformina, bloqueadores de los canales de calcio) inhiben la transmisión de señales de LOX-1. FABP4, un mediador del metabolismo de los lípidos, se dirige a la aterosclerosis y la diabetes.
La MPO se produce por neutrófilos, monocitos y macrófagos y cataliza la modificación de lipoproteínas de baja densidad. Los niveles elevados de MPO se asocian con la enfermedad arterial coronaria, y la MPO en plasma es un predictor temprano de riesgo de infarto de miocardio.
Las MPM están implicadas en la remodelación del tejido vascular y la aterosclerosis. RETN se asocia con obesidad, diabetes tipo 2 y ECV. La inhibición de la caspasa 3 se investiga para el tratamiento y prevención de la insuficiencia cardíaca. TGF-b1 se involucra en la hipertrofia cardíaca y la regulación de la renina-angiotensina. Los polimorfismos del TGF-b1 se correlacionan con la hipertensión, y los pacientes hipertensos tienen nivel más alto de TGF-b1. FCEVA, un mediador de la angiogénesis, también aumentó en la DA.
Varias proteínas clave asociadas con el riesgo de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular en la piel lesionada y/o no lesionada también se correlacionaron de forma significativa con la gravedad de la enfermedad, como IL-18, FCEVA y enzima 2 convertidora de angiotensina, que regula la función cardiovascular y renal. La expresión elevada significativa en las proteínas inflamatorias y en las asociadas a aterosclerosis/enfermedad cardiovascular en la piel con DA no lesionada, junto con las correlaciones más significativas entre la gravedad y las expresiones de proteínas no lesionales en comparación con las lesionales, enfatiza la naturaleza sistémica de la DA.
Para investigar el origen primario de estas proteínas inflamatorias y de las asociadas con mayor riesgo de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular (si se originan en la piel y luego se escapan a la sangre, o se inician en la sangre y se distribuyen a la piel a través del suministro de sangre), se evaluó la relación entre la piel lesionada y proteómica de la sangre. Los hallazgos sugieren que es probable que la piel sea la fuente de la mayor expresión de estas proteínas, ya que sus expresiones proteicas en las lesiones de DA fueron mayores de forma significativa en comparación con los niveles en sangre. Además, la firma proteómica de la piel capturó muchos más marcadores que el perfil sanguíneo, de acuerdo con los reportes anteriores en suero. El número limitado de correlaciones entre la proteómica de la sangre y la piel también implica que las proteínas elevadas de la piel no se depositan de forma simple por el suministro de sangre. En cambio, es más probable que la proteína se filtre de la piel a la sangre.
También se evaluaron las diferencias entre ARNm y expresiones proteicas en piel lesionada con DA. Aunque el perfil transcriptómico de DA se estudió de manera extensa, no hay investigaciones sobre si el ARNm se traduce de forma final en proteína. En general, las expresiones de ARNm y proteínas se correlacionaron de forma significativa, lo que indica la traducción local de proteínas en la piel. Esto sugiere que la piel es la fuente principal de las proteínas con mayor expresión. Muchas proteínas y productos de genes se encontraron con mayor expresión en la piel lesionada, tanto en el Olink como en la plataforma ARNseq. Estas incluyeron proteínas relacionadas con la aterosclerosis, como IL-6, MPM, ESEL, OSM y el receptor de IL-33, ST2/IL1RL1. Se sugiere que OSM es un biomarcador de aterosclerosis, los niveles séricos elevados de OSM se correlacionaron de forma significativa con estenosis coronaria. La vía IL-33/ST2 desempeña un doble papel en la inflamación tipo 2 en las enfermedades cardiovasculares. Los ensayos clínicos para IL-33 (NCT03533751) y OSMR (NCT03754309) mostraron eficacia preliminar en adultos con DA moderada a grave y también pueden beneficiar a pacientes con riesgo de comorbilidades cardiovasculares.
Varios marcadores de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular mostraron proteínas con niveles mucho más altos en lugar de mayor expresión de ARNm, como ESEL, MPO, FABP4, HMOX1, y proteinasa 3, que se asocia con insuficiencia cardíaca. Esto se puede atribuir a la acumulación de proteínas debido a una vida media más larga o a un efecto amplificador que conduce a una mayor traducción.
Algunos productos génicos también mostraron una mayor expresión de ARNm que de proteína, incluidos FLT3LG, IL-6, IL-10, IL-20, IL-12/23p40, S100A12 y CCL3. Estas proteínas pueden ser menos estables que los ARNm y, por lo tanto, se degradan más rápido o se consumen mediante la unión y la absorción por los receptores. En este caso, la falta de proteína no implica de manera necesaria una falta de función; puede mediar una transmisión fuerte de señales por medio de la unión al receptor, que al final resulta en niveles disminuidos.
Una limitación de este estudio es que el análisis proteómico se limitó a 354 marcadores. Sin embargo, hasta donde se sabe, éste es el primer estudio proteómico en muestras de biopsia y el más grande en piel. Otra limitación es que el ARNm sanguíneo no está disponible; sin embargo, los estudios proteómicos en sangre apoyan la piel como fuente primaria de proteínas inflamatorias.
CONCLUSIÓN
En general, este estudio identificó la firma proteómica de la DA del adulto en especímenes de biopsias de piel. Los estudios futuros deben intentar validar también este método en niños y en estudios longitudinales. El aumento de las proteínas asociadas al riesgo de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular en la piel con DA e incluso en la piel “normal” (no lesionada) enfatiza la importancia del tratamiento proactivo. Estos datos sugieren que la piel en lugar de la sangre es la fuente principal de la firma inflamatoria y de aterosclerosis/enfermedad cardiovascular. El perfil proteómico de la piel puede ser valioso para futuros estudios que requieran una estrecha monitorización de biomarcadores. Esto es importante de forma particular al tener en cuenta que la plataforma OLINK requiere tan solo 10 mcg por tejido, que se puede adquirir de manera fácil con tan solo una biopsia por punción de 1 mm (o 10 mcL de suero).
The proteomic skin profile of moderate-to-severe atopic dermatitis patients shows an inflammatory signature
Published:October 25, 2019DOI:https://doi.org/10.1016/j.jaad.2019.10.039
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Maricela Hernández Robles Profesor
Dra. María del Rocío Salinas Díaz Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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