Hay numerosas plantas a las que las personas reaccionan de forma alérgica. Una de las especies de alérgenos que se convierte de forma gradual más prominente en Europa es la planta de la maleza invasora ambrosía. Esta especie puede producir alrededor de mil millones de granos de polen por planta y la concentración de polen parece ser independiente del uso del suelo (urbano o rural), en especial porque su actividad alergénica restante puede mostrarse incluso después del transporte a larga distancia.
Hay varios estudios disponibles que utilizaron diferentes métodos para determinar una visión más profunda de la dinámica, la distribución y el impacto en la salud humana del polen de ambrosía. Los métodos sofisticados para determinar la presencia de alérgenos específicos o proteínas en general son el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y la inmunomicroscopía electrónica de oro (IMEO). Con el primer método es posible obtener la concentración de alérgenos específicos de forma cuantitativa. El segundo método permite encontrar la posición exacta de los alérgenos al marcarlos con nanopartículas de oro. Ambos métodos en este estudio se usan para obtener información acerca del principal alérgeno del polen de la ambrosía Amb a 1 (Ambrosia artemisiifolia) en el aire de Viena durante la temporada alta de polinización de agosto a septiembre de 2017.Para permitir este análisis, las pruebas tienen que recolectarse durante un periodo de tiempo apropiado y si son diferentes se usan sitios de medición que tienen que relacionarse con el clima regional. Hay diferentes métodos disponibles de muestreo para recolectar partículas en el aire: impactador de cascada, ciclón, precipitador electrostático, filtro absoluto o condensación a base de agua por nombrar sólo algunos. Uno de los métodos que se usa de forma común es el impactador en cascada, que permite la recolección de aerosoles en diferentes fracciones de tamaño de partículas para un análisis posterior. En especial para la IMEO las partículas del aire deben examinarse en su estado natural tanto como sea posible. Así, la alteración de las partículas debido al muestreo debe mantenerse al mínimo. Requerimientos adicionales para el estudio presentado es una buena densidad de la muestra con respecto a su resolución temporal y espacial. Para cumplir con estos requisitos, los filtros absolutos (FA) investigan cuál es la forma estándar en los sitios de control de calidad del aire. En la ciudad examinada Viena hay varios sitios disponibles, desde el centro de la ciudad hasta las regiones exteriores más rurales, por lo tanto, se dispone de una buena resolución lateral y temporal que está disponible sin ningún esfuerzo adicional, como instalar nuevos equipos de recolección. Otro beneficio del uso de FA es que se obtienen dos fracciones principales de diferentes tamaños de partículas recolectadas de forma simultánea, MP2.5 (materia particulada 2.5: fracción de partículas con un diámetro aerodinámico de <2.5 μm) y MP10 (materia particulada 10: fracción de partículas con un diámetro aerodinámico de <10 μm). En los sitios de medición utilizados se instalan ciclones frente a los FA, los cuales preseleccionan y separan el diámetro máximo de partículas que pueden llegar al filtro. Como el tamaño máximo de partículas de fracción más grande de MP10 es de 10 μm, no debería estar presente grano de polen intacto de un diámetro equivalente de volumen típico de 20 μm en las investigaciones subsecuentes. El inconveniente de usar FA es que ambos métodos de investigación usados en este estudio tienen que adaptarse al uso del material de filtro. Miguel et al mostraron que es posible obtener información acerca del potencial alérgeno de la MP10 con filtros de los sitios de monitoreo de la calidad del aire en una base de promedio mensual. Para el análisis presentado, el objetivo fue ilustrar una tendencia estacional; por lo tanto, se debe alcanzar un tiempo de agrupación mucho más pequeño de una semana. Además, dado que el nivel de alérgenos en el aire suele variar en gran medida en tiempo y lugar, el estudio se inició para obtener información sobre los aeroalérgenos de la ambrosia en la temporada alta en Viena y sus alrededores.
MÉTODOS
Material biológico
Para examinar las características centrándose en el potencial alergénico del polen de ambrosía disponible de forma fresca y comercial, el polen fresco se recolectó durante la temporada alta a finales de agosto 2017 en el sur de Estiria/Austria. El polen disponible de forma comercial se compró en Bonapol (Ambrosia elatior [artemisiifolia]). Dado que los granos enteros de polen de ambrosía tienen un diámetro equivalente en volumen de 20 μm, el polen colectado se purificó por tamizado para separación de partículas extrañas y de mayor tamaño. Antes de la adquisición de datos, ambos tipos de pólenes se almacenaron a 4ºC.
Sitios de monitoreo/filtros de polvo fino
Para el análisis de filtros de polvo fino en Viena, los filtros absolutos que capturan MP10 y MP2.5 se proporcionaron por “Umweltschutzabteilung (Departamento de Protección Ambiental)- MA22” Viena. Los FA analizados se recolectaron de forma diaria en agosto y septiembre de 2017 y se originaron en dos sitios de monitoreo de la calidad del aire en Viena, Lobau y Taborstrasse. Estos FA de fibra de vidrio (60 g/m2, tipo: Qual.227/1/60 150 mm) se adquirieron de Munkell y se utilizaron de forma estándar para medir la concentración de polvo fino en diferentes sitios de Viena. Acorde con la información del fabricante, la eficiencia del filtro de partículas entre 0.12 μm a 0.30 μm es de 99.30% y para partículas más grandes de 0.30 μm es 99.96%.
Las dos ubicaciones se marcaron en la Figura 1. Uno de los dos sitios se ubica en el centro de la ciudad (Taborstrasse), donde se investigaron los filtros de MP10 y MP2.5. El segundo se localizó más afuera en la región “rural” (Lobau), desde donde se investigaron los filtros de MP2.5. Para la concentración en el aire de polen [número de polen/m3] el dato oficial proviene del “Pollenwarndiesnst (servicio de alerta de polen de Austria)” que se obtiene de la estación de medición ubicada en el techo del Centro Médico de la Universidad de Viena cerca del centro de la ciudad, ver Figura 1.
ELISA: Determinación de la actividad alergénica de Amb a 1 en filtros de polvo fino
La cuantificación del alérgeno de polen de ambrosía Amb a 1 se realizó mediante un Elisa específico al alérgeno. El kit de Elisa se adquirió de Indoor Biotechnologies, Inc. (EL-AM1) y se incluyó el protocolo que se utilizó. Para la determinación de la actividad alergénica medida en unidades (U, de forma típica mU), los filtros recolectados dentro de una semana se agruparon (cuatro semanas en agosto de 2017 y dos semanas en septiembre de 2017). Los filtros agrupados se extrajeron con fosfato amortiguado con solución salina (FAS) (10 mM, 0.05% Interpolado 20, pH 7.4) en tubos adecuados mientras se agitaron a 200 rMP) agitador orbital, Varioshake VS8 OE, Lauda/Bartelt; amplitud de agitación = 10 mm) a 22 ±2°C. Después de la extracción, las muestras se diluyeron de forma adecuada en FAS que contenía 1% de ASB (albúmina de suero bovino) para una posible cuantificación del alérgeno dentro del rango de detección. El rango de detección se definió con un alérgeno estandarizado de Amb a 1 aplicado dentro del kit de ELISA con un rango de 0.5 a 250.0 mU/ml. Para ELISA, todas las incubaciones se realizaron a 22 ± 2°C en placas de 96 pocillos (Nunc, MaxiSorpTM, ThermoFiher Scientific), los cuales se cubrieron con anticuerpos de captura policlonal de conejo anti-Amb a 1 con amortiguador de carbonato (50 Mm, Ph 9.6) y se incubaron durante la noche a 4-8ºC. Después de lavar las placas tres veces con FAS que contiene Tween 20 al 0.05% v/v, los pocillos se llenaron con I ASB/FAS Tween 20 al 1% para bloquear proteínas inespecíficas de forma potencial y se incubaron por 30 minutos de forma aproximada. Después de repetir los pasos de lavado con FAS-Tween 20, las muestras, que incluyen las diluciones apropiadas, así como el Amb a 1 estándar se agregaron a los pocillos. Después de la incubación por una hora, las placas se lavaron como antes y se añadieron anticuerpos policlonales biotinilados de conejo, que son específicos al alérgeno Amb a 1. De forma secuencial, después de 1 hora de incubación las placas se lavaron de nueva forma tres veces y se agregó la estreptavidina-peroxidasa (Sigma-Aldrich) y se incubaron durante 30 minutos. Como sustrato, se agregó 1 mM 2.2´-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico sal de amonio, Sigma Aldrich) en combinación con H2O2 30% en amortiguador de citrato (70 Mm, Ph 4.2) después de lavar las placas 3 veces. Después del desarrollo del color, la absorción resultante de cada pocillo se midió de forma fotométrica a una longitud de 405 nm mediante el lector multietiqueta de placas (Victor3, Perkin Elmer).
Preparación para microscopía electrónica
Dado que los filtros absolutos estandarizados se utilizan en el control de calidad del aire, los filtros que se investigan son predeterminados. De forma usual, las partículas se extraen del aire o una solución en filtros específicos como sustratos para obtener resultados fiables concernientes a su morfología y composición. Aquí a menudo se usan diferentes métodos para prevenir aglomeraciones o superposiciones de diferentes partículas. Sin embargo, estudios muestran que la extracción con solvente o ultrasonicación puede alterar las características de recolección de la materia particulada. La inmunomicroscopía electrónica de oro se usa para encontrar en qué partículas está presente el alérgeno, para obtener información acerca de sus morfologías. Por lo tanto, para evitar una posible alteración en la partícula, la manipulación de la muestra se mantuvo al mínimo, por lo que no se realizó extracción de partículas en la investigación presentada. Además, con el fin de excluir una influencia de adicionar un recubrimiento conductivo, se realizaron imágenes directas de las muestras en el modo de bajo vacío de un MEBA (Microscopio electrónico de barrido ambiental). Este modo versátil, en el que se usa vapor de agua como gas formador de imágenes, permite la investigación de especímenes no conductores de forma eléctrica de la ciencia de materiales y ciencia de la vida, ya sea de forma estática, dinámica o incluso en tres dimensiones. Los FA usados tienen un diámetro estándar de 150 mm. Para obtener un tamaño de muestra adecuado para el procedimiento de marcaje con inmunooro, se utilizó un sello de metal redondo afilado fabricado de forma interna con un diámetro de 2 mm. En lugar del martilleo, el prensado suave fue suficiente para extraer las muestras del FA original. Después del proceso de etiquetado, las muestras terminadas se fijaron con cinta de carbono de doble adhesivo en trozos de microscopio electrónico de barrido de aluminio y de manera posterior se investigaron mediante el uso de un ESEM Quanta 600 FEG (FEI, Oregón). Para la imagen de los electrones retrodispersados (BSE) se usó contraste, debido a que los valores de grises de la imagen son una función monótona del número atómico del material investigado. Así, las nanopartículas de oro usadas para marcar el alérgeno tienen de forma típica un valor gris alto en comparación con sus materiales circundantes y pueden localizarse de forma fácil.
Anticuerpos y conjugación con oro
Para permitir un marcaje específico de la proteína bajo investigación, Amb a 1, se usó un anticuerpo monoclonal primario (MA-5F6 anti Amb a 1, Indoor Biotechnologies, UK). Este anticuerpo se eligió debido a su especificidad alta para un solo epítopo que se refleja en una reacción cruzada baja. En procedimientos usuales de etiquetado se utiliza un protocolo de “dos pasos” para conjugar las nanopartículas de oro al anticuerpo primario. Aquí, en el primer paso, el anticuerpo primario se une a la proteína bajo investigación. De forma subsecuente, un anticuerpo secundario, ya conjugado con nanopartículas de oro, se une a un anticuerpo secundario en un segundo paso. Los contrastes altos de las nanopartículas de oro con el fondo en diferentes modos de imagen permiten la detección de la proteína bajo investigación en una transmisión de microscopio electrónico (TME) o en un ESEM. Como se menciona en el siguiente capítulo, los pasos de transferencia deben mantenerse al mínimo para evitar una posible pérdida de partículas. Para evitar el segundo paso de preparación, se utilizó un enfoque diferente. Dentro de este método, el anticuerpo primario se conjuga de forma directa con la nanopartícula de oro. Se utilizó un kit de conjugación de nanopartículas (InnovaCoat © GOLD, formerly Expedeon, US) para unir de forma covalente el anticuerpo primario usado a la nanopartícula de oro. Con ello, un “paso único” se pudo adquirir el procedimiento de etiquetado, veáse el siguiente capítulo.
Protocolo de etiquetado de inmunooro
Durante el establecimiento de la técnica de preparación apropiada para permitir que el etiquetado de inmunooro de partículas finas de polvo que contienen alérgenos (aeroalérgenos) de forma directa sobre filtros de polvo fino se señaló que se deben minimizar los pasos de transferencia y lavado. Esto se debió al hecho de que con cada paso las partículas finas de polvo pueden salir del FA. Por lo tanto, se combinaron varios pasos de etiquetado y se redujeron al mínimo los pasos de lavado. Todas las soluciones siguientes se prepararon de forma reciente antes de su uso. Se evitó el paso usual inicial de fijación, con, por ejemplo, glutaraldehído, ya que no se pudo determinar ninguna diferencia medible. Esto podría deberse al hecho de que la muestra bajo investigación se constituye en su mayoría de componentes inorgánicos. Para cada caso individual, se dejó caer una gota de 1 ml de la solución respectiva sobre una película hidrofóbica (Bemis, Parafilm, MP996, WI 54956) en una matriz de gotas. Para el procedimiento de etiquetado posterior, los discos se colocaron boca abajo sobre la gota respectiva y por la naturaleza hidrofóbica del FA sólo la parte superior del filtro se sumergió en la solución. El primer paso fue 30 minutos de incubación con PBS (15 Mm, Ph 7.2) mezclado con Tween 20 al 0.05% v/v y 2% de BSA. Para neutralizar esa solución, las muestras se lavaron con PBS cuatro veces, cinco minutos cada una. De forma posterior, el anticuerpo primario, ya conjugado con nanopartículas de oro, se diluyó en solución de PBS 1:5000 y se incubó entre 22 ± 2 horas a 4 °C. Para eliminar este exceso de solución, las muestras se lavaron dos veces con PBS y al final se lavaron dos veces con agua bidestilada, cinco minutos cada uno y secado al aire. Era necesario el último paso de lavado, para evitar formación de cristales generalizados de sal, que dificultan una investigación del área cubierta. Como el bajo vacío se usó en modo de un ESEM para la obtención de imágenes, no fue necesario ningún otro paso de preparación. Como control positivo polen de ambrosía molido en molino de bolas y como control negativo polen de pasto molido en molino de bolas se dispersaron sobre FA nuevos. La Figura 2 muestra a modo de ejemplo dos imágenes SEM de control positivo y negativo de polen molido fijado en cinta de carbón con doble adhesivo rotulado en la misma forma que se indica en este subcapítulo.
Resultados
Los filtros de polvo fino agrupados de forma semanal se analizaron de manera cuantitativa por ELISA desde la primera semana de agosto a la segunda semana de septiembre. De forma adicional, la suma de las mismas semanas de la concentración de polen de ambrosía se utilizó para obtener información sobre la estación general de floración de Viena, ver Figura 3. Esto se puede ver que ya al comienzo de la temporada de polen con concentraciones bajas de polen en el aire, se encuentran concentraciones altas de Amb a 1 en todas las fracciones medidas. Además, se debe mencionar que en el periodo anterior a agosto sólo se detectó polen disperso (la suma de las semanas 3a y 4a de julio son 1 y 10 polen, de forma respectiva). De modo subsecuente al comienzo de la temporada de polen, una concentración bastante constante de polen de ambrosía condujo a una disminución de la concentración de alérgenos de todas las fracciones de MP hasta la semana 4, donde la concentración fue inferior al límite de detección. Durante la temporada alta de polinización de ambrosía en la primera semana de septiembre, se pueden encontrar las concentraciones más altas de alérgenos esperadas en todos los sitios de medición. Aunque la concentración de polen disminuyó de forma rápida en la segunda semana de agosto, la concentración de alérgenos se mantuvo alta de forma comparativa. De manera subsecuente, la concentración del polen acumulado de la semana 3 de septiembre se mantuvo en un nivel de polen moderado de 56 y se redujo a sólo 2 en la semana 4. Los resultados de ELISA muestran que el alérgeno Amb a 1 está presente en partículas mucho más pequeñas que un grano de polen entero de aproximadamente 20 μm, ya que sólo las partículas de menos de 10 μm o 2.5 μm deben estar presentes en el FA investigado. Otra indicación que sólo fracciones/partículas están presentes en el FA es que durante todas los exámenes de SEM no se encontraron granos de polen intactos en los filtros investigados de forma microscópica.
Para obtener información acerca de la posición exacta del alérgeno cuantificado de ambrosía vía ELISA, se realizó el marcaje con inmunooro en los filtros que mostraron la mayor concentración de alérgeno detectada en la primera semana de septiembre. Para cada uno de los 21 FAs disponibles (dos MP2.5 y uno MP10 7 días cada uno), se preparó al menos una pieza de filtro con el protocolo de etiquetado. De forma subsecuente, sólo se examinaron los filtros que mostraban una señal más fuerte de forma significativa en el control positivo que en el control negativo. En total, dos piezas de FA MP2.5 (Lobau y Taborstrasse) y dos MP10 (Taborstrasse) se examinaron. Como se analizaron los FA de dos sitios diferentes de monitoreo de la calidad del aire con dos tamaños nominales diferentes de MP, también las morfologías de las partículas deberían ser diferentes. La Figura 4 muestra de manera representativa el resultado del etiquetado de uno de los filtros de MP10 de la Taborstrasse. La primera fila muestra A el control negativo que está menos marcado de forma significativa que el control positivo en B. Se debe mencionar que no se observó ningún etiquetado significativo del propio filtro. Las imágenes C a F muestran algunos de los etiquetados de partículas MP10. Como era de esperar, la mayoría de las partículas marcadas son de origen orgánico, pero como se puede observar en la Figura 4, C y D, también se pueden encontrar inclusiones minerales, lo cual se concluyó por su estructura brillante y granular dentro de matrices más oscuras (ver, por ejemplo, las marcas circulares rojas en las dos imágenes). Es notable que algunas de las partículas observadas son mayores de 10 µm. Esto podría deberse a la circunstancia de que no es posible un corte estricto en diámetros de partículas aerodinámicas de 10 µm para el monitoreo estacionario de la calidad del aire. Otra explicación es que las aglomeraciones de partículas más pequeñas se fusionan durante el proceso de depósito.
La misma medida que para la MP10 se realizó para ambos FAs de MP2.5 de Taborstrasse y Lobau. La Figura 5 muestra de manera representativa un FA de MP2.5 etiquetado de Lobau desde la primera semana de septiembre, donde A muestra el control negativo y B el control positivo del etiquetado más alto de forma significativa. Como los datos de la investigación de MP10 ya lo demostraron, se encontraron algunas partículas que son más grandes que el diámetro esperado de 2.5 µm (ver, por ejemplo, Figura 5, C). Las imágenes adicionales en la Figura 5, D a F, muestran que la mayoría de las partículas marcadas son más pequeñas que el diámetro aerodinámico dado de 2.5µm, como se esperaba. Las dos marcas verdes acentúan regiones de acumulaciones, donde podría determinarse la no distinción de partículas individuales.
Como las imágenes de las partículas marcadas estaban disponibles, es posible medir las morfologías de las partículas, como el diámetro más largo. Por lo tanto, una primera evaluación de la distribución del tamaño de partícula (DTP) de las partículas en las fracciones MP10 y MP2.5 se puede obtener al buscar y medir de forma manual las partículas apropiadas en todas las áreas investigadas. El principal problema de los datos presentados fue que la mayoría de las partículas marcadas se encuentran como aglomerados (ver, por ejemplo, las marcas verdes en las Figura 5, E y F). Aquí, las regiones etiquetadas parecen ser grupos de partículas individuales pequeñas para las que no es posible una diferenciación clara con respecto al tamaño individual. Para la DTP, sólo se contaron las partículas aisladas distintas, como en la Figura 4, D y E, sin sombreado de la partícula del FA como en la Figura 4, C. Por lo tanto, sólo pudo encontrarse un número limitado de partículas individuales disponibles. Para la fracción de MP10, se encontraron un total de 27 partículas y para la fracción de MP2.5 un total de 28 partículas en todos los FA investigados.
La Figura 6 muestra un diagrama de las partículas detectadas, el cual da una primera idea de los tamaños más frecuentes de partículas detectadas que se etiquetaron contra el alérgeno de ambrosia Amb a 1. En todos los FA, la mayoría de las partículas etiquetadas se localizaron en el extremo inferior de la DTP, esto es, en la fracción de tamaño más pequeño de partículas. Esto puede deberse a dos posibles circunstancias: la mayoría de las partículas depositadas en el filtro se pueden encontrar de forma natural en la fracción más baja de la DTP o las partículas más grandes son más susceptibles que las más pequeñas a ser eliminadas por el lavado del filtro durante el procedimiento de etiquetado. Las partes D a F de la Figura 5 son ejemplos de posibles aglomerados encontrados de forma repetida de partículas pequeñas que se etiquetaron de manera alta. Esto indica que la DTP encontrada corresponde con la distribución actual. Para obtener información acerca de las partículas que se lavaron del FA durante el procedimiento de etiquetado, se hicieron las imágenes en el modo de bajo vacío de ESEM de los residuos después de la evaporación de la solución. La Figura 7 muestra una imagen BSE de unos de estos residuos. De manera desafortunada, la mayoría de las partículas son partículas salinas cristalizadas que es probable que se superpongan a las partículas lavadas. Por lo tanto, no se puede hacer una predicción clara acerca del tipo y el tamaño de las partículas que se perdieron durante la preparación de la muestra. Por lo tanto, las DTP establecidas sólo se deben ver como primera indicación de tamaños de partículas que contienen alérgenos, pero no se puede realizar una evaluación estadística. Sin embargo, el procedimiento mostrado da la posibilidad de investigar aeroalérgenos de una forma bastante natural. Al usar un método de conteo más automatizado debería ser posible obtener más conteo de partículas en un tiempo razonable, y permitir así una evaluación estadística.
Conclusiones
Las mediciones de ELISA muestran una evidencia clara de concentraciones comprobables de alérgenos en polvos finos de MP10, así como MP2.5 en la temporada de polen de ambrosía que se empezaron investigar en ambas localizaciones en Viena en 2017. La mayor concentración de alérgeno Amb a 1 se encontró durante la concentración alta relacionada de polen en la primera semana de septiembre. Aunque la concentración subsecuente de polen cae después de este periodo pico al nivel anterior, la concentración de alérgenos se mantiene alta de forma comparativa en todas las fracciones y ubicaciones de MP. La investigación de SEM con inmunooro revela que el alérgeno de Amb a 1 se puede encontrar tanto en partículas orgánicas como en aglomerados de orgánicas e inorgánicas. El análisis inicial del tamaño de las partículas mostró que los portadores de alérgenos pueden encontrarse en la fracción de partículas más pequeñas investigadas en este estudio de menos de 1 μm. En orden para obtener suficientes recuentos de partículas que permitan un análisis estadístico significativo, se necesitan más investigaciones. Sin embargo, el estudio presentado mostró ambos métodos, ELISA e IMEO, que pueden también aplicarse sobre filtros estandarizados usados en los sitios de monitoreo de la calidad del aire, que se configuran de forma integral. Su uso podría permitir investigaciones de variaciones temporales y locales altas de aeroalérgenos, sin el esfuerzo de instalar un nuevo equipo de medición de aerosoles.
Manfred Nachtnebel, Bernadette Führer, Gabriele Ettenberger-Bornberg, Johannes Mertl, Lilian Kaufmann, Hartmuth Schroettner, Johannes Rattenberger, Determination of ragweed allergen Amb a 1 distribution in aerosols using ELISA and immunogold scanning electron microscopy, Journal of Allergy and Clinical Immunology: Global,Volume 1, Issue 4,2022,Pages 265-272,
Dra. Med. Sandra Nora González Diaz Jefe y profesor
Dra. Med. Gabriela Galindo Rodríguez Profesor
Dra. Karen Patricia Chávez Jiménez Residente 1er año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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