Dinámica de la activación inmunocitaria durante el tratamiento con inmunoglobulina intravenosa en la enfermedad de Kawasaki

La enfermedad de Kawasaki (EK) es una enfermedad febril aguda con vasculitis sistémica en la primera infancia. La complicación más grave de la EK es el desarrollo de lesiones arteriales coronarias (LAC), que pueden causar la muerte súbita. El diagnóstico y la aplicación de inmunoglobulina intravenosa (IGIV) tempranos son muy importantes para prevenir la formación de LAC. La IGIV es el tratamiento estándar para la EK; sin embargo, no es efectiva en 10 a 20% de los niños con EK. Antes se demostró que los monocitos activados, en especial los monocitos CD14⁺CD16⁺, aumentan en la fase aguda de la EK y disminuyen después de la IGIV, lo que sugiere que los monocitos activados desempeñan un papel central en la inflamación en la EK. Sin embargo, no está claro si la activación de los monocitos está involucrada en la fisiopatología de la EK resistente a IGIV. Además, varios estudios sugieren que la activación de las células T se asocia con EK resistente a IGIV.

También se reportó que las células T que expresan el antígeno leucocitario humano (HLA)-DR pueden involucrarse en la fisiopatología de la EK resistente a IGIV. En este estudio, se investigó la dinámica de los monocitos periféricos CD14⁺CD16⁺, células CD4⁺HLA-DR⁺ y células CD8⁺HLA-DR⁺ antes y después del tratamiento con IGIV en pacientes con EK sensible a IGIV o resistente a IGIV.

Método

Reclutamiento de pacientes

De 176 pacientes con EK ingresados en el Hospital Universitario de Yamaguchi desde enero de 2011 hasta mayo de 2016, se inscribieron 46 pacientes con EK, con datos disponibles. Se excluyeron los pacientes infectados con Streptococcus pyogenes, Yersinia o adenovirus. Todos se diagnosticaron con EK de acuerdo con las Guías Diagnósticas para EK (quinta edición). Los síntomas principales de EK consisten en fiebre que persiste durante ≥5 días, congestión conjuntival bilateral, eritema de los labios y la cavidad oral, exantema polimorfo, cambios en las extremidades periféricas y linfadenopatía cervical aguda no purulenta. Según el número de síntomas principales distintos de la fiebre que aparecieron antes del diagnóstico, se definió a la EK incompleta (≤3) y EK completa (≥4).

Cuatro de los pacientes incluidos sufrieron LAC agudas 30 días después de la aparición de la EK, mientras que los otros 42 pacientes no tuvieron LAC durante o después del tratamiento. Todos los pacientes recibieron al inicio IGIV (2 g/kg) y aspirina oral (30 mg/kg al día) y se clasificaron en grupos respondedores a IGIV y resistentes a IGIV. El primero incluyó a 30 pacientes que mostraron defervescencia dentro de las 48 horas posteriores al inicio del primer tratamiento con IGIV y no requirieron tratamiento adicional. El último incluyó a 16 pacientes que requirieron terapia adicional después del primer tratamiento con IGIV. Como se muestra en la Figura 1, se usaron dosis repetidas de IGIV, corticoesteroides,  infliximab (IFX) y/o ciclosporina A (CsA) como tratamientos adicionales hasta la defervescencia completa. Se reclutaron controles de referencia por edad de niños sanos (11 niños, siete niñas; edad media 46 meses; rango 1-59 meses) (Tabla complementaria S1).

Ética y consentimiento

Este estudio se aprobó por la junta de revisión institucional del Hospital Universitario de Yamaguchi (no. H26-88). Los tutores de todos los pacientes incluidos en este estudio dieron su consentimiento informado.

Citometría de flujo

Se recolectó sangre completa heparinizada de niños durante la fase aguda de la EK antes y después del inicio de la IGIV. En el grupo IGIV eficaz, se obtuvieron muestras de sangre en los días 2-9 después del inicio de la EK (mediana: día 5) antes del tratamiento (Figura 1) y en los días 5-13 (mediana: día 8) después de la IGIV (Figura 1). En el grupo resistente a la IGIV, se obtuvieron muestras de sangre en los días 2-8 después del inicio de la EK (mediana: día 4) antes del tratamiento (Figura 1) y en los días 6-35 (mediana: día 8) después de la IGIV, justo antes de la última terapia efectiva (Figura 1). Las muestras se analizaron poco después de la recolección y se marcaron con anti-HLA-DR conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), complejo de proteína de clorofila peridinina (PerCP) conjugado con CD4 antihumano de ratón y CD8 de ratón antihumano conjugado con fitoeritrina (PE) para evaluar la activación de células T. Las muestras se marcaron con anti-CD14 conjugado con PerCP y anti-CD16 conjugado con FITC para examinar monocitos activados periféricos. Se utilizó inmunoglobulina de ratón conjugada con FITC G1 (IgG1), IgG2a de ratón conjugada con PerCP, IgG1 de ratón conjugada con PE e IgG2a de ratón conjugada con FITC como controles negativos, de forma respectiva.. Los eritrocitos se lisaron con la solución de lisis FACS (BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, EE. UU.). Las células crecieron y se resuspendieron en flujo FAC (BD Biosciences). Para cada muestra, se analizaron 5000 células con un citómetro de flujo FACSCaliburTM (BD Biosciences) equipado con el programa CellQuest (BD Biosciences).

Análisis estadístico

Las diferencias se analizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney o la prueba exacta de Fisher. Los cambios en los sujetos antes y después de la IGIV se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon de rango con signo. Los resultados con valores de p < 0.05 se consideraron significativos de forma estadística. Los análisis y cálculos se realizaron con Excel 2010 (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.) Con el complemento Statcel 3 (OMS, Tokio, Japón).

Resultados

Características de la EK resistente a IGIV y sensible a IGIV

Las características clínicas de los pacientes se compararon entre EK sensible y resistente a IGIV (Tabla 1). No hubo diferencias en la demografía de los pacientes, incluidos el género, la edad, el tipo de enfermedad y la formación de LAC.

Con respecto a los puntajes de predicción de respuesta de IGIV, los puntajes de Osaka fueron más altos en pacientes resistentes a la IGIV que en pacientes con efectividad a la IGIV (p = 0.02). La proporción de neutrófilos fue mayor en el grupo resistente a la IGIV. Por el contrario, los niveles séricos de sodio, la proporción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el número absoluto de PBMC, linfocitos y monocitos fueron más bajos de manera significativa en el grupo resistente a la IGIV que en el grupo IGIV eficaz. También se compararon estos parámetros en niños masculinos y femeninos con EK (tabla suplementaria S2).

Activación previa al tratamiento de monocitos y linfocitos T en la EK sensible a IGIV y resistente a IGIV

Los números absolutos y las proporciones de células CD4⁺, CD8⁺ y CD14⁺ circulantes antes de la IGIV inicial se muestran en la Tabla 1. Ni el número absoluto ni la proporción de células CD14⁺CD16⁺ difirieron entre pacientes con IGIV eficaz y resistente a IGIV. En contraste, los números de pretratamiento de células CD4⁺, CD4+HLA-DR+, CD8⁺ y CD8⁺HLA-DR⁺ entre los linfocitos fueron más bajos en pacientes resistentes a IGIV que en pacientes con IGIV efectiva (p = 0.02, p = 0.03, p <0.01 y p = 0.04, de forma respectiva).

La cinética de las células CD4⁺, CD8⁺ y CD14⁺ activadas antes y después de la IGIV

Los cambios en las células CD4⁺HLA-DR⁺, CD8⁺HLA-DR⁺ y CD14⁺CD16⁺ mediante el tratamiento con IGIV se muestra en la Figura 2. El número absoluto de células CD14⁺CD16⁺ disminuyó de manera significativa después de la terapia inicial en el grupo IGIV efectiva (p < 0.01) pero no en el grupo resistente a la IGIV.

El número de células CD4⁺HLA-DR⁺ aumentó después de la IGIV en ambos grupos (ambos p < 0.01), mientras que el número de células CD8⁺HLA-DR⁺ aumentó sólo en el grupo resistente a IGIV (p < 0.01). El número absoluto de células CD14⁺CD16⁺ antes de la IGIV en todos los pacientes fue mayor comparado con los niños sanos (p < 0.01) (Tabla complementaria S1). El números de células CD4⁺HLA-DR⁺ y CD8⁺HLA-DR⁺ antes de la IGIV fue menor en todos los pacientes que en los niños sanos (p < 0.01) (Tabla suplementaria S1). También se compararon estos parámetros en pacientes masculinos y femeninos con EK (Tabla complementaria S2).

Discusión

El presente estudio reveló la dinámica de los monocitos y la activación de las células T antes y después del tratamiento con IGIV en la EK con IGIV efectiva y resistente. La restauración de la supresión de las células T en lugar de la activación de los monocitos puede reflejar la respuesta de la IGIV en pacientes con EK. La EK es una vasculitis sistémica no específica, y la causa subyacente es aún desconocida. Si bien la IGIV es el tratamiento estándar inicial para la EK, el mecanismo de su respuesta sigue sin estar claro. Se reportaron marcadores de células T activadas, como el receptor soluble de la interleucina 2, en pacientes con EK resistente a la IGIV. Debido a que los porcentajes de células CD3⁺, CD4⁺ y CD8⁺ se elevan de manera significativa en pacientes con EK con IGIV eficaz, la magnitud de la activación de células T suprimidas en pacientes con EK podría predecir la respuesta al tratamiento con IGIV. Otro reporte sugirió que la IGIV inhibió la activación de las células T CD8⁺ y que la hiperactivación de las células T CD8⁺ puede inducir resistencia a la IGIV debido a la insuficiente eficacia de la IGIV. Un estudio de asociación de todo el genoma mostró que un polimorfismo en ITPKC, que codifica 1,4,5-trifosfato 3-cinasa C y regula la activación de las células T, puede asociarse con la susceptibilidad y el aumento de la gravedad de la EK. Además, se reportó antes que la expresión de HLA-DR es menor en las células CD4⁺ y CD8⁺ durante la fase aguda de la EK. El presente estudio mostró que los números absolutos de células CD4⁺HLA-DR⁺ y CD8⁺HLA-DR⁺ eran más bajos en pacientes resistentes a la IGIV que en pacientes con IGIV efectiva antes del tratamiento con IGIV. Por lo tanto, la activación de las células T antes de la IGIV se suprime de forma más fuerte en la EK resistente a la IGIV que en la EK eficaz a la IGIV. Además, el número de células CD4⁺HLA-DR⁺ aumentó de manera significativa después de la IGIV en ambos grupos, mientras que el número de células CD8⁺HLA-DR⁺ aumentó de forma significativa sólo en la EK resistente a la IGIV después del tratamiento con IGIV. Estos resultados sugieren que la supresión de las células CD4⁺ y, en particular, las células CD8⁺ mejoró después de la IGIV en la EK resistente a la IGIV. Se cree que las respuestas inmunes mediadas por células CD8⁺ predominan en los pacientes con EK efectiva a IGIV y que la EK puede hacerse más sensible a tratamientos adicionales al aumentar las células CD8⁺ activadas. Además, la mejora suficiente de la supresión de células CD8⁺ puede predecir la respuesta al tratamiento..

Este estudio tiene algunas limitaciones. El tamaño de la muestra fue pequeño y, por lo tanto, se necesitan más estudios con más sujetos para evaluar las implicaciones precisas del tratamiento con IGIV en pacientes con EK. Debido a que no se investigó la proporción de células T CD3⁺HLA-DR⁺ en este estudio, no se puede excluir la posibilidad de una pequeña población de células asesinas naturales entre las células CD8⁺.

Conclusión

Se sugiere que la inhibición insuficiente de la activación de monocitos por la IGIV puede asociarse con la resistencia a la IGIV. Además, la restauración de la actividad de CD8⁺ suprimida puede asociada con la resistencia a la IGIV. Por lo tanto, se cree que el sistema inmune relacionado con CD8 muestra un papel importante en la fisiopatología de la EK resistente a la IGIV.

C Matsuguma, H Wakiguchi, Y Suzuki, S Okada, T Furuta, Y Ohnishi, Y Azuma, S Ohga & S Hasegawa (2019) Dynamics of immunocyte activation during intravenous immunoglobulin treatment in Kawasaki disease, Scandinavian Journal of Rheumatology, 48:6, 491-496, DOI: 10.1080/03009742.2019.1604992

Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México

Dra. Med. Sandra Nora González Díaz         Jefe y Profesor

Dra. med. Gabriela Galindo Rodríguez        Profesor

Dra. Ligia Libeth Carrasco Díaz                   Residente 1er Año

Dra. Alejandra Macías Weinmann                Profesor