1. Introducción
La alergia al polen es un problema importante para un porcentaje considerable de personas en todo el mundo que está en constante aumento, por lo que es de gran interés monitorear el potencial alergénico del aire. La evaluación de la concentración de polen en el aire es una herramienta tradicional. Sin embargo, las concentraciones diarias de polen no siempre coinciden con los síntomas de las personas alérgicas al polen o con el contenido de alérgenos en el aire. Esto se debe en gran medida a que los alérgenos del polen en el aire también se encuentran en las fracciones sin polen. A partir de aquí, surge la pregunta si son adecuados los métodos disponibles en la actualidad para medir la alergenicidad atmosférica.
El conocimiento sobre la influencia de las condiciones climáticas en la liberación de alérgenos todavía es escaso y se debate. Sin embargo, se sabe que los factores meteorológicos afectan en gran medida a las fluctuaciones del polen y los alérgenos. Pueden afectar a la cantidad de polen en el aire en forma directa o, de forma indirecta causar su ruptura y así provocar la liberación de alérgenos.
Los alérgenos son específicos del polen o, como en el caso de los panalérgenos, pueden compartir la secuencia y la conformación estructural, lo que lleva a reacciones cruzadas entre el polen no relacionado y, a menudo, también entre el polen y los alimentos. Los panalérgenos de las plantas más relevantes en la clínica son las profilinas, las polcalcinas, las proteínas no específicas de transferencia de lípidos y los miembros de las proteínas relacionadas con la patogénesis de la familia 10. Las profilinas son proteínas pequeñas de unión a la actina, ubicuas y multifuncionales involucradas en la dinámica del citoesqueleto de la actina y esto explica su expresión ubicua y de niveles altos de conservación. La conservación de su estructura primaria alcanza homologías de 86% y de 73% en el caso del olivo (Ole e 2) con profilinas de polen de Betula y pastos, de manera respectiva, y la conservación de las estructuras secundarias y tridimensionales lleva a una reactividad cruzada fuerte de moléculas serológicas.
Las profilinas tienen una relevancia alergénica importante, ya que pueden provocar respuestas nasales y bronquiales en pacientes sensibles. En todo el mundo, la prevalencia de la sensibilización a la profilina se encuentra entre 5% y 42%, mientras que, para algunas de las profilinas, las tasas de sensibilización pueden alcanzar proporciones como alérgenos principales (>50%) (por ejemplo, la Pho d 2 de la Phoenix dactylifera y la Fra e 2 del Fraxinus excelsior). Dado que las profilinas son proteínas alergénicas y que su concentración en el aire puede verse influenciado no sólo por la concentración de polen sino también por factores meteorológicos, se determinaron las fluctuaciones diarias del polen en el aire y las concentraciones de aeroprofilinas y, en paralelo, se examinaron qué factores meteorológicos fueron los más influyentes. Para ello, se eligieron dos ciudades europeas con diferentes condiciones climáticas: León (España) y Bolonia (Italia). Estas ciudades difieren en la geografía, la topografía, el clima y otras características ambientales (población, industrialización, contaminación, etc.), y las diferencias en las condiciones ambientales afectan la presencia y la abundancia de los taxones vegetales. Las dos ciudades se seleccionaron para un análisis entre la concentración de polen y los factores meteorológicos.
En las muestras de polen de las dos ciudades, se investigó el efecto de la rehidratación del polen in vitro sobre la liberación de proteínas, entre las que se encontró la profilina. La rehidratación del polen ocurrió de acuerdo con los valores de la humedad relativa en la atmósfera, lo que provocó la liberación de proteínas de los granos de polen. La liberación rápida de las proteínas alergénicas en medios acuosos durante la rehidratación del polen es un evento observado en diferentes pólenes; esta condición imita la interacción entre el polen y la mucosa humana. Las profilinas son abundantes en el polen y, debido a su solubilidad alta, se liberan en cantidades grandes en el medio de cultivo durante la hidratación y la germinación in vitro del polen. En el documento actual, esta característica se investigó in vitro en granos de polen de especies diferentes y se analizó a la luz de los datos sobre el polen y la muestra de alérgenos recolectados en las dos ciudades analizadas.
2. Material y métodos
2.1. Muestreo de aire
El muestreo del polen se realizó de manera continua a partir de marzo a junio de 2015 con dos trampas volumétricas de registro de siete días tipo Hirst (VPPS, 2000 sampler, Lanzoni S.r.l., Bolonia, Italia) con un caudal de succión de 10 L/minuto. La información del polen se expresó como concentraciones medias diarias de polen, granos de polen por metro cúbico de aire (polen/m3), según la terminología recomendada para estudios aerobiológicos.
El aerosol atmosférico para la cuantificación de la fracción alergénica se tomó con un muestreador de volumen bajo, un muestreador de ciclón orientado en viento continuo con un caudal de succión de 16.5 L/min (Burkard Manufacturing Co. Ltd.). La eficiencia del muestreo de este aparato se describió por Emberlin y Moreno Grau. Las partículas atmosféricas se recolectaron secas directo en un vial de 1.5 ml cada 24 horas durante el período de muestreo del polen y de las mismas estaciones de muestreo y luego se almacenaron a -20°C.
La trampa tipo Hirst y el muestreador del Ciclón Burkard se ubicaron en el mismo sitio de muestreo, es decir, en una terraza de 15 m a.g.l en el campus de la Universidad de León (España).El muestreador del Ciclón Burkard se ubicó en el techo (25 m a.g.l., a.g.l.= altura sobre el nivel del suelo) del edificio ISAC-CNR en Bolonia (Italia) y la trampa tipo Hirst en el techo (20 m a.g.l.) del edificio ARPA en Bolonia (http://www.arpae.it/).
2.2. Detalles de las estaciones de monitoreo
La ciudad de León (838 m a.g.l.) se encuentra en el noroeste de la Península Ibérica. Desde el punto de vista biogeográfico, la ciudad pertenece a la región mediterránea y tiene un clima continental. El promedio climático de algunos parámetros meteorológicos es de 2,624 horas de sol, 78 días de lluvia y 16 días de tormenta. La temperatura media es de 10.9°C con una precipitación anual de 560 mm. En invierno, hay 74 días de heladas y 16 días de nieve, pero las nevadas fuertes no son frecuentes. El verano es cálido, pero seco y templado por la altitud de la ciudad, con una temperatura máxima de alrededor de 27°C y una velocidad del viento superior a 5 m/s. La ciudad de Bolonia (54 m a.g.l..) se ubica cerca de las montañas de los Apeninos al sur de la llanura Po, una gran área plana en el norte de Italia que pertenece a la región Continental. Esta zona se caracteriza por un clima subcontinental. El promedio climático de algunos parámetros meteorológicos es de 1,950 horas de sol, 75 días de lluvia y 8 días de tormenta. La temperatura media es de 14°C con una precipitación anual de 780 mm con un período xerotérmico en julio y agosto. En invierno, hay un promedio de 11 días de heladas y 6 días de nieve. El verano es cálido y muy húmedo, con una temperatura máxima de alrededor de 31°C, la humedad relativa de 60-84% y una velocidad baja del viento, de menos de 3 m/s.
2.3. Extracción de proteínas desde las muestras de Cyclone y la cuantificación inmunoquímica de las profilinas
La extracción de muestras se realizó como se reportó con anterioridad, con modificaciones menores. De forma breve, las muestras en seco de Cyclone se centrifugaron a 18 000 x g durante 1 minuto y luego se extrajeron a temperatura ambiente durante 2 horas con 120 μL de buffer de fosfato (50 mM pH 7.0) y se complementó con 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, Tween al 0,005% 20, y 125 mM de bicarbonato de amonio. El extracto se separó por centrifugación a 2000 x g durante 10 minutos y luego se almacenó a -20°C.
El contenido de profilina en las muestras extraídas se cuantificó con el método de enzimoinmunoanálisis de adsorción de doble anticuerpo (ELISA) descrito antes. De forma breve, las placas ELISA (Greiner, Frickenhausen, Alemania) se recubrieron de forma previa durante la noche con 0.25 μg/pocillo de anticuerpo monoclonal antiprofilina (anti-Ole e 2, capaz de unir y detectar polen de profilinas) (3H8 y 5F2) (Bial Industrial Farmacéutica, Zamudio, España) a temperatura ambiente y luego se bloquearon con 200 μL/pocillo de PBS-BSA-T (1% de albúmina de suero bovino, BSA, 0.05% de Tween 20 en PBS). Enseguida, los pocillos se incubaron con 100 μL de muestras extraídas en el aire. Las placas se incubaron con 100 μL/pocillo de anticuerpo policlonal anticuerpo antiprofilina de conejo biotinilado (anti-Ole e 2, capaz de unir y detectar el polen de profilinas) a 1 μg/mL (Bial Industrial Farmacéutica, España) y luego con 100 μL/pocillo de la peroxidasa conjugada con estreptavidina (0.25 μg/ml en PBS-BSA-T). Todas las incubaciones se realizaron a 37°C durante 1 hora seguidas de tres lavados con 200 μL por pocillo de PBS-BSA-T entre etapas sucesivas. Por último, la actividad de la enzima se determinó al agregar 200 μL/pocillo de o-fenilendiamina (set de tabletas Sigma-FastTM) e incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La curva estándar se construyó a partir de ocho diluciones de profilina purificada (Ole e 2) (Pharmacia, Uppsala, Suecia), a partir de un stock de 1 000 ng/ml. Todos los extractos se diluyeron de manera que los valores estuvieran dentro del rango lineal de la curva de calibración. En cada caso, la curva final se obtuvo como un promedio de las dos lecturas de absorbancia para minimizar el error potencial. Las muestras se analizaron por duplicado y las concentraciones diarias se interpolaron de la curva estándar y se expresaron en pg/ml. Luego, los datos se convirtieron a pico gramos por metro cúbico de aire según el volumen muestreado por el aparato.
2.4. Hidratación de polen in vitro, cuantificación de proteínas y Western Blot
La hidratación del polen in vitro y la liberación de proteínas se llevaron a cabo como se describió antes, con modificaciones menores. De forma breve, el polen (100 mg) se hidrató en un medio de hidratación de 1 ml (ácido bórico 1.6 mM, cloruro de calcio 27 μM en sacarosa al 12%) en lugar de PBS. El contenido de la proteína en los sobrenadantes se midió con el método de unión al colorante de Bradford, con el BSA como estándar de referencia. Se separaron las proteínas (20 µg) mediante electroforesis desnaturalizante en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego se electrotransfirieron en membranas de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpos policlonales antiprofilina de ratón durante 2 horas. Después del lavado, las membranas se incubaron con IgG antiratón conjugada con fosfatasa alcalina (1:10 000; Sigma-Aldrich), durante 1 hora a temperatura ambiente. El etiquetado se detectó con el sustrato colorimétrico CTAB (Sigma-Aldrich). Para la cuantificación, se escanearon las membranas y se determinaron las intensidades de la banda con el programa de análisis de imágenes ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij).
2.5. Información meteorológica
Para la ciudad de León, los datos meteorológicos se otorgaron por el Aeropuerto de León, de la Agencia Española de Meteorología (AEMET) (estación meteorológica a 6 km de distancia de los muestreadores de polen y partículas). En Bolonia, la estación meteorológica se encontraba en la misma ubicación del muestreador de polen y los datos meteorológicos se proporcionaron por la Agencia Regional para la Prevención, el Medio Ambiente y la Energía de Emilia-Romagna (ARPAE). Las temperaturas (ºC) máximas (T max), mínimas (T min) y medias (T med), las precipitaciones (R; mm), la humedad relativa (RH; %) y la velocidad del viento (WS; m/s) se registraron siempre durante el período de muestreo de aeroalérgenos y también para los períodos inmediatos previos y posteriores.
2.6. Análisis estadístico
El coeficiente de correlación de rango de Spearman se utilizó para datos no paramétricos con el fin de analizar las correlaciones entre los parámetros meteorológicos y las concentraciones de polen/alérgeno. El nivel de significancia se evaluó entre una P < 0.01 y una P < 0.05. Se utilizó el programa estadístico SPSS, versión 21.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) para todos los análisis estadísticos. El análisis de los componentes principales (PCA) se realizó con el programa SPSS con una rotación VARIMAX. Las diferencias entre los conjuntos de muestras se determinaron mediante análisis de varianza (ANOVA de una vía, con un valor de umbral P de 0.05) y la prueba posterior de Tukey, se realizó con GraphPad Prism.
3. Resultados
3.13 Concentraciones de polen y su dependencia en los parámetros meteorológicos
Durante el período de observación, se determinó el polen de varios taxones en la atmósfera de Bolonia y de León. Las más abundantes en ambas ciudades pertenecían a las familias de Corylaceae/Betulaceae, Cupressaceae, Oleaceae, Pinaceae, Poaceae y Urticaceae y a los géneros Plantago, Populus, Quercus yRumex. La Integral de Polen Estacional (SPIN): Ʃ la concentración diaria promedio durante el período estudiado fue 18,478 polen*día/m3 en Bolonia y 27,013 polen*día/m3 en León.
El polen de los árboles fue dominante en ambas ciudades, conformó 69..1 y 78.4%, mientras que las gramíneas representaron 16.4 y 10.9% y las plantas herbáceas alergénicas (Plantago, Rumex y Urticaceae) 14.0 y 10.1% de la cantidad total de polen recolectado en Bolonia y en León.
Se observaron varios picos en la concentración de polen. En Bolonia, el primero y más grande ocurrió en marzo y predominó el polen de Cupressaceae, mientras que el polen de Oleaceae y Corylaceae estuvo presente en cantidades más bajas. Mientras que la polinización de estas plantas disminuyó, éstas se unieron al Quercus y Platanus, lo que causó un segundo pico durante la segunda mitad de abril. El período comprendido entre finales de abril y la primera mitad de mayo se caracterizó por cantidades grandes de polen de Poaceae, Urticaceae, Oleaceae y Pinaceae (Fig. 1).
Hubo un retraso importante en las concentraciones de polen de Cupressaceae entre Bolonia y León. De hecho, aunque abundaron desde finales de febrero hasta finales de marzo en Bolonia, sólo estuvieron presentes en León a partir del 20 de marzo. El polen de Quercus mostró una demora de más de un mes entre Bolonia (pico máximo el 15 de marzo) y León (pico máximo el 11 de mayo). Además, el polen en el aire perteneciente a las Corylaceae estuvo ausente en León, mientras que en Bolonia no había polen en el aire de Betulaceae.
La correlación no paramétrica del rango de Spearman proporcionó coeficientes de correlación entre las concentraciones de polen en el aire y varios parámetros meteorológicos, en particular la temperatura, las R, la RH y la WS. Las cuatro variables meteorológicas analizadas afectaron de manera diferente la aparición de polen en las dos ciudades. De hecho, los resultados mostraron correlaciones significativas entre la concentración de polen y la T max y la T med para la ciudad de León, mientras que estas variables meteorológicas no afectaron de manera significativa la dispersión de polen en Bolonia, donde sólo la T min lo afectó de manera negativa. En ambas ciudades, la RH afectó de manera negativa la cantidad de polen en el aire, mientras que las R sólo lo hicieron en la ciudad de Bolonia (Tabla 1). La WS no se correlacionó de manera significativa con la aparición de polen en ninguna de las ciudades, mientras que hubo una correlación negativa con la T min. En general, la concentración de polen se afectó de manera negativa por las R y la RH.
3.2. Concentración de profilinas atmosféricas y su dependencia en la cantidad de polen en el aire y los parámetros meteorológicos
La Integral de Alérgenos Estacionales: Ʃ de la concentración promedio diaria de profilinas durante el período estudiado varió entre 2,776.41 pg*día/m3 en Bolonia y 10,400.39 pg*día/m3 en León.
La potencia del polen con profilinas (pg/granos de polen) entre los dos sitios muestreados varió con 0.15 para Bolonia y 0.38 para León.
Los resultados de la correlación de rango de Spearman indicaron un coeficiente de correlación (rs) de 0.357, p < 0.0001 para Bolonia y un rs = 0.590, p < 0.0001 para León entre las concentraciones de profilina y el polen. Los picos de concentración de profilina y de polen no siempre coincidieron (marcados con un asterisco en la Fig. 1), en particular, los picos de profilina detectados en Bolonia del 27 al 28 de marzo, del 15 al 16 de abril, del 28 de abril al 9 de junio no correlacionaron con concentraciones altas de polen. El mismo escenario se observó en León, donde ninguno de los picos de profilina ocurrió durante los días con mayor concentración de polen (Fig. 1). La concentración de polen que mejor se correlacionó con la concentración de profilina (Tabla 1) se presentó y se comparó con los picos de profilina. Esto reveló un desajuste marcado entre el polen de los taxones individuales y las concentraciones de profilina, tanto en Bolonia como en León (Fig. 1). En León, sólo la concentración de polen Rumex coincidió con los picos de profilina. Sin embargo, esto sólo podría explicar en parte los picos de profilina, ya que la contribución del polen de Rumex a la cantidad total de polen en el aire fue menor que la contribución de otros taxones (por ejemplo, Quercus, Pinaceae y Plantaginaceae).
Se realizó un PCA para investigar los factores meteorológicos que influyen en las concentraciones de profilina en la atmósfera (Fig. 2). En Bolonia, tres componentes principales explicaron 94.1% de la varianza: Componente 1 (temperaturas), Componente 2 (RH y R) y Componente 3 (WS). Para la ciudad de León, dos componentes principales explicaron 76.9% de la varianza: Componente 1 (temperatura) y Componente 2 (RH, R y WS).
Con respecto a los diversos tipos de polen (Fig. 3), en Bolonia las correlaciones más altas correspondieron al polen Corylus, Quercus, Platanus, Oleaceae, Pinaceae y Rumex, que juntas explicaron 75% de la varianza. En León, las correlaciones más altas correspondieron a Oleaceae, Pinaceae, Quercus, Plantago, Poaceae y Rumex, que en conjunto explicaron 69.7% de la varianza.
3.3. Liberación de proteínas por polen hidratado
También se investigó la cinética de la liberación de proteínas y de profilina del grano de polen mediante la hidratación del polen in vitro. El polen de Parietaria judaica, Betula pendula, Olea europaea, Phleum pratense, Ambrosia artemisiifolia, Corylus avellana, Populus deltoides y Citrus clementine se usó para este propósito debido a su potencial alergénico. Además, estos son pólenes alergénicos comunes en una o ambas ciudades objeto del estudio durante sus temporadas de floración.
En general, hubo una liberación masiva de proteínas dentro de los primeros 10 minutos de hidratación del polen en todo el polen analizado, excepto Betula pendula y Ambrosia artemisiifolia. Mientras que la Betula pendula no mostró una liberación tan masiva de proteínas en el medio de germinación dentro del tiempo analizado, el polen de Ambrosia artemisiifolia mostró una liberación de proteínas dependiente del tiempo durante los primeros 25 minutos de hidratación. En general, la mayoría de las proteínas se retuvieron en los granos de polen incluso después de la hidratación con sólo dos excepciones, Populus deltoides y Citrus clementina (Fig. 4).
La profilina liberada durante la rehidratación se analizó mediante inmunotransferencia. El panalérgeno fue detectable en todo el polen como una banda de peso molecular bajo (12-15 kDa), lo que indica una especificidad muy alta del anticuerpo contra la proteína de interés. Aunque la cantidad de profilina liberada no siempre correspondía a la cantidad de proteína presente en el medio de cultivo, tal relación se observó en el caso de Parietaria judaica, Ambrosia artemisiifolia, Populus deltoides y Olea europaea (Figs. 4 y 5). Betula pendula, Corylus avellana, Phleum pratense y Citrus clementine mostraron, en cambio, una liberación de profilina dependiente del tiempo durante la hidratación (Fig. 5). En conjunto, estos datos indican que la hidratación provoca una liberación significativa de proteínas de los granos de polen y que también se puede extruir una proteína citoplásmica como los panalérgenos como la profilina.
4. Discusión
Los resultados revelaron diferencias en la aparición del polen y de la profilina, de acuerdo con las diferentes estaciones de polinización. En particular, el polen de los árboles tuvo las principales diferencias estacionales en las dos ciudades, ya que las concentraciones máximas de Cupressaceae y Quercus se retrasaron en León en 15 y 30 días de manera respectiva, esto debido a retrasos en las estaciones de polen en León en comparación con Bolonia. Tal vez, esto fue causado tanto por las condiciones meteorológicas como por la presencia de diferentes especies deQuercus en las dos ciudades. De hecho, Q. pyrenaica, Q. faginea (dos especies marcescentes) y Q. ilex (especies perennes) son las especies predominantes en León, y la última tiene un período de floración retrasado en comparación con las otras especies de Quercus. Bolonia, en cambio, se caracteriza por la presencia de Q. petraea, Q. cerris y Q. pubescens, una especie submediterránea, que crece en regiones caracterizadas por una humedad alta y con veranos calurosos e inviernos fríos con poca lluvia y en general habitan en una colina seca en extremo y laderas de montaña. La duración de ciertas estaciones (por ejemplo, Oleaceae) y las fechas de algunos picos de concentración de polen (por ejemplo, Pinaceae) fueron comparables entre León y Bolonia. El polen de pastos y otras plantas herbáceas mostró una duración similar de la temporada de polen y concentraciones de polen en las dos ciudades.
Los datos se basan en el conteo tradicional de polen microscópico, incluso si en la actualidad, un enfoque molecular basado en qPCR demuestra ser un método alternativo válido también para el monitoreo de polen, ya que identifica con éxito diferentes especies de Juniperus en muestras de polen en el aire. Los autores concluyeron que un enfoque de qPCR para identificar y cuantificar el polen puede proporcionar datos más confiables que con la identificación morfológica por medio de microscopía, que requiere un palinólogo capacitado y una metodología estándar que garantice la calidad, la precisión y la reproducibilidad de los datos, como lo destacó el Grupo de Trabajo EAS, que propuso una actualización de los Requisitos Mínimos. Sin embargo, el método de qPCR presenta limitaciones, como la ausencia de datos de secuencia adecuados para especies de interés.
La temperatura y la HR se correlacionaron con la concentración de polen en el aire; en general, las R en cantidad más grande y las temperaturas más bajas correspondieron a una concentración más baja de polen. Esto coincide con la idea de que las temperaturas medias y el fotoperíodo afectan en gran medida a las cantidades de polen. Además, los factores meteorológicos, como la temperatura, afectan el tiempo de floración, y también la liberación de polen. En este estudio, se mostró una correlación positiva entre la temperatura diaria y las concentraciones de polen de árboles, de pastos y otras especies herbáceas, lo que confirma los datos de estudios anteriores.
También se observó una correlación negativa entre las R y las concentraciones diarias de polen de árboles, gramíneas y herbáceas. Esta correlación negativa, también reportada en varios estudios, se conoce como el fenómeno del “lavado de la lluvia”. El viento es otro factor clave ya que causa la liberación de polen de las plantas. También causa la dispersión del polen en la atmósfera y puede transportar el polen lejos del lugar de origen, lo que da lugar a un transporte de largo alcance de granos completos de polen, así como partículas de polen e incluso alérgenos. Los resultados actuales no apuntan a una correlación significativa entre la WS y las concentraciones de polen en el aire.
Tomados en conjunto, estos datos muestran que los parámetros meteorológicos afectan la ocurrencia y la distribución del polen en el aire que pertenece a varios taxones.
Hubo una correlación grande entre las concentraciones de polen en el aire y la presencia del panalérgeno profilina, como ya se demostró para varias otras proteínas alergénicas. Sin embargo, estos resultados también muestran que el calendario polínico y la asociación con los factores meteorológicos deben tenerse en cuenta al controlar el riesgo de alergia. De hecho, se demostró que la temperatura, las R y la RH afectan en gran medida no sólo la concentración de polen, sino también la cantidad de profilina en el aire. En general, en cuanto al polen, una HR más alta, T min baja y R alta corresponden a una concentración más baja de profilina en la atmósfera. En cuanto al polen, también la concentración de profilina no se correlacionó con la WS, sin embargo, los pocos datos acerca de las concentraciones de profilina (ya que se monitoreó una temporada de polen) son una de las explicaciones de que no existe una correlación significativa después del dispositivo de pruebas estadísticas. De hecho, las concentraciones altas de profilina detectadas el 11 y 12 de mayo en la ciudad de León pueden explicarse, al menos en parte, por las masas de aire que soplan desde el sur de España y Portugal (caracterizadas por temperaturas más cálidas y estaciones de floración más tempranas en comparación con León principalmente de las especies de Olea) que causan el transporte de polen a una distancia larga (datos no mostrados). Además, se demostró que en la Olea europaea las profilinas se adhieren a la exina del grano de polen después de la difusión, lo que causa un posible retraso entre la emisión de las proteínas y los picos de profilina en el aire. Ésta es una hipótesis y la relación entre la concentración de profilina y la WS, al analizar los mapas meteorológicos y las trayectorias de las masas de aire en gran escala, es un objetivo ambicioso, aún.
Estudios realizados con Quercus rubra, Betula spp, Criptomeria japonica, Plantago lanceolata, y el polen de las gramíneas mostraron correlaciones bajas o medias entre el alérgeno en el aire y las concentraciones de polen. Otros reportes destacaron el hecho de que las concentraciones de polen de Platanus y Olea no son representativas de la exposición a sus principales alérgenos, Pla a 1 y Ole e 1. Como consecuencia, la concentración de polen no siempre es sincrónica con la gravedad de los síntomas alérgicos en personas alérgicas al polen, como se demostró para tres tipos de polen importantes, a saber, Betula, Poaceae y Ambrosia en Austria y Alemania. Un estudio de tres años realizado en cuatro regiones europeas (es decir, Austria, Alemania, Francia y Finlandia) señaló que la concentración de los alérgenos investigados (los alérgenos principales de Betula y Poaceae, Bet v 1 y Phl p 5 de manera respectiva), en lugar de la concentración de polen tuvo un impacto más fuerte en la carga de síntomas de los pacientes alérgicos al polen. Por último, como se notó para muchos alérgenos principales, este estudio mostró que los picos en la concentración del panalérgeno profilina no siempre se superponen con los picos de la concentración de polen. Además del monitoreo de los principales alérgenos, también es de gran interés monitorear los panalérgenos. En primer lugar, porque, en algunos casos, se comportan como alérgenos importantes con tasas de sensibilización >50%, pero también porque los panalérgenos aumentan la probabilidad de los síntomas alérgicos, y estallan en individuos alérgicos en diferentes ubicaciones geográficas caracterizadas por la presencia de polen diferente y no relacionado.
Es importante destacar que la presencia de la IgE específica contra estas moléculas en el suero de pacientes alérgicos lleva a múltiples procesos de sensibilización a fuentes diferentes, incluidos los alérgenos alimentarios en el caso de las profilinas y otros panalérgenos. Se sabe que durante la germinación in vitro del polen, una gran cantidad de proteínas involucradas en especial en el metabolismo de los carbohidratos y la energía, el transporte y la remodelación de la pared, se expresan en exceso y se liberan en el medio de germinación. Esto es consistente con la evidencia sobre las cantidades de proteínas que se liberan de manera rápida cuando los granos de polen entran en contacto con los fluidos y es coherente con su papel en la comunicación cruzada entre el polen y el pistilo. Estos hallazgos concuerdan con los datos reportados en este estudio, en los que se demostró la liberación repentina y constante de proteínas tras la rehidratación del polen in vitro. Entre las proteínas liberadas, se reportó que los alérgenos de Cryptomeria japonica, Poaceae, Lolium perenne, Zygophyllum fabago, Cupressus arizonica y Cupressus sempervirens también se liberaron en el medio externo.
En este sistema, la liberación de una gran cantidad de proteínas polínicas era una característica común, pero el momento era específico de la especie, esto debido a la arquitectura diferente de la pared polínica, es decir, las estructuras de la exina y la intina. Un estudio europeo sobre la liberación de alérgenos (Proyecto HIALINE) demostró que el polen de pasto liberó 2.0-2.5 pg/grano de polen de los alérgenos del grupo 5, los principales alérgenos del polen de pasto. Sin embargo, las especies de plantas, la fenología, la concentración de polen en el aire y las condiciones climáticas alteraron este valor. También la contaminación parece alterar no sólo la liberación de proteínas del grano, sino también la expresión de varias proteínas, entre las que se encuentran también los alérgenos y los panalérgenos, como se demostró para el Cor a 1 y las profilinas de Corylus avellana y para el principal alérgeno del polen de Betula Bet v1. En ambos casos, la expresión dentro de las condiciones de crecimiento urbanizadas fue mayor en comparación con la muestra de las áreas rurales.
Los resultados actuales confirman que las profilinas (proteínas similares a Ole e 2) y las proteínas citoplasmáticas también se liberaron tras la rehidratación del polen. Como las profilinas están involucradas en la modulación del citoesqueleto de actina en el polen en la germinación, no está claro por qué la profilina debe detectarse fuera del grano de polen tras la hidratación del polen, a menos que uno asuma una función en la interacción polen-estigma. De hecho, a pesar de la homología alta, las secuencias de profilina mostraron también una tasa alta de polimorfismos, obtenida por múltiples copias de genes, modificaciones postraduccionales y cambios en las regiones de unión de las parejas, lo que lleva a un múltiplo de isovariantes con diferencias fisicoquímicas y diferencias en la unión de las propiedades de los ligandos. Esto podría tener una influencia directa en la función celular y la localización.
El momento de esta liberación podría explicar la desalineación del polen en el aire y los picos de perfil en el aire. El diferente tiempo requerido para extruir la proteína en el medio externo puede depender de su localización subcelular. De hecho, en los granos rehidratados de polen de abedul, la localización de la profilina fue diferente de la observada en el grano seco ya unos pocos minutos después de la rehidratación; en este último, se encontraron agregados de estas proteínas citoplásmicas tanto dentro como fuera del grano. El momento de la liberación de alérgenos es un parámetro importante, ya que se correlaciona con la alergenicidad. De hecho, en el polen de abedul, la glutatión-S-transferasa (GST), un alérgeno abundante, se considera un alérgeno menor ya que su liberación es limitada en comparación con otros alérgenos (por ejemplo, Bet v 1), lo que demuestra que la alergenicidad también podría depender de la cinética de liberación de proteínas de los granos de polen.
Para completar este escenario, la profilina y otras proteínas alergénicas podrían derivar no sólo de granos enteros de polen, sino también de partículas más pequeñas, que se dispersan aún más rápido. Se encontró que la humedad alta favorece la liberación de alérgenos detectada en las subpartículas de polen que podrían penetrar más profundo en las vías respiratorias. Además, los alérgenos polínicos pueden sufrir aglomeración o adsorción en las partículas suspendidas en el aire (PM), que se comportan como un portador. Las proteínas de origen tanto vegetal como animal representan hasta 5% de las PM de aire urbano, que pueden encontrarse tanto en la PM gruesa (10-2.5 μm) como en la PM fina (PM 2.5 μm). Dado que la presencia de alérgenos en la PM gruesa y fina del aerosol tiene una relevancia clínica, ya que estas partículas cargadas de alérgeno son pequeñas e ingresan a las vías respiratorias humanas, es de gran interés recolectar todas aquellas partículas que contienen alérgenos y para este propósito, el muestreo del aerosol atmosférico total para la cuantificación de la profilina total en el aire se realizó con el muestreador Burkard.
5. Conclusiones
En conclusión, estos hallazgos apuntan a la necesidad de considerar la aerobiología molecular además de la concentración de polen para monitorear el riesgo para la salud asociado con la exposición a los alérgenos del aire. Estos resultados sugieren que la concentración de alérgenos de polen en lugar de concentraciones de polen puede ser un parámetro más relevante. Sin embargo, esta hipótesis se basa en los datos actuales sobre el perfil de panalérgenos y la bibliografía limitada. Por esta razón, el conocimiento se beneficiaría en gran medida de una investigación más profunda, más amplia y a largo plazo de los alérgenos en el aire y de la difusión de panalérgenos y su relación con la concentración de polen. De hecho, este estudio se centró en un único panalérgeno, la profilina, cuyas concentraciones se midieron durante una temporada en dos ciudades y no se sabe si otros alérgenos (mayores o menores) se comportaron de la misma manera.
Además, la tecnología se beneficiaría de los avances económicos y del ahorro de tiempo en la detección y la identificación de partículas alergénicas. Por último, puede ser útil complementar el pronóstico de proteínas polínicas alergénicas en la atmósfera con estudios in vitro sobre el porcentaje de hidratación que cada tipo de polen necesita para su activación metabólica.
Behavior of profilins in the atmosphere and in vitro, and their relationship with the performance of airborne pollen
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC. Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Med. Lucía Leal Villarreal Profesor
Dr. Roberto Carlos Ramírez Rodríguez Residente 2° Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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