jueves, 2 de junio de 2016

El desarrollo y función in vivo de las células T 9 cooperadoras

Las células T cooperadoras (TH) son un subconjunto de células que se diferencian a partir de células T CD4 que se expusieron a un ambiente de citocinas especializadas (cuadro 1; Fig. 1). En comparación con otros subconjuntos descritos de células TH, las células TH9 (que se definen por su secreción de la interleucina 9 [IL-9]) están menos bien caracterizadas, y es de manera reciente que se comenzaron a comprender los factores que controlan su desarrollo y función. Schmitt y colaboradores describieron por primera vez la producción de IL-9 por las células T de ratón activado y de manera posterior definieron las citocinas que promueven la diferenciación de las células TH productoras de IL-9 en cultivos. Las células T productoras de IL-9 se asociaron primero con respuestas in vivo tipo TH2 y, debido a que los estudios iniciales de función de la IL-9 sugieren que esta citocina tiene efectos restringidos durante la respuesta inmune, esto no se estudió de manera tan extensa como muchas otras citocinas que se asocian con las células TH. Por otra parte, la falta de entendimiento de cómo derivar células TH altamente polarizadas que producen IL-9, obstaculizó la investigación adicional del control molecular de la expresión del gene Il9.

La descripción inicial de células TH polarizadas que secretan IL-9 se hizo a partir de experimentos en los que las células T se cultivaron en presencia de IL-2, IL-4 y factor transformante de crecimiento β (TGF). Aunque la estimulación de células T con la IL-4 por sí sola no era suficiente para inducir la producción de IL-9, se prepararon las células para producir IL-9 cuando se estimularon con citocinas adicionales. Veldhoen y colaboradores revisaron este paradigma al demostrar que las células TH2 productoras de IL-4 plenamente diferenciadas que se cultivan en presencia de TGFβ producen de forma subsecuente IL-9. Dardalhon y colaboradores encontraron que la misma combinación de citocinas puede preparar la producción de IL-9 por las células T, y mostraron que la trasmisión de señales mediada por IL-4 promovió la diferenciación celular de TH9 en parte al suprimir la habilidad del TGFβ para inducir la expresión del factor de transcripción caja de cabeza de tenedor P3 (FOXP3) asociado a las células T reguladoras (Treg). Por lo tanto, el equilibrio de las señales inducidas por estos estímulos determina la extensión de la generación de las células Th9.
En esta revisión, se integra el entendimiento actual de los factores que controlan el desarrollo y la función de las células TH9 en la respuesta inmune y la enfermedad. Se centra en algunas de las funciones más recientes descritas para las células TH9 en la enfermedad atópica y la enfermedad inflamatoria intestinal, y en la promoción efectiva de la inmunidad antitumoral.
Regulación del desarrollo celular de Th9
La secuencia final de transmisión de señales del receptor de células T (TCR), moléculas coestimuladoras y el receptor de citocinas que promueve la diferenciación de células TH9 es una red de factores de transcripción que regulan la expresión de genes del patrón celular TH9, como IL-9 (FIG. 2). En contraste con las señales coestimuladoras y las citocinas que inducen la activación transitoria de factores de transcripción tales como el factor nuclear-κB (NF-κB) y el factor nuclear de células T activadas (NFAT) para estimular de forma aguda la producción de IL-9, las citocinas como la IL-4 y el TGFβ regulan múltiples genes en las células TH9, lo que conduce a la generación de un locus Il9 que está a punto de ser activado en respuesta a la estimulación subsecuente. Esta sección de la revisión se centra en cómo las señales inducidas por las citocinas regulan la generación de células TH9, incluso mediante la activación de señales de transducción y el activador de transcripción de proteínas (STAT), lo cual es un primer paso en la diferenciación del subtipo de células TH (Caja 1), y por medio de la activación inducida por el TGFβ de las proteínas SMAD, que pueden altear el curso de la transmisión de señales en la diferenciación de las células TH9.
STAT6 en el desarrollo celular de TH9. El STAT6 es el principal componente de la transmisión de señales del receptor de la IL-4 (IL-4R) y se requiere para la generación in vitro de las células TH9. Aunque STAT6 podría unirse de manera directa al locus Il9, está claro que el STAT6 quizá tenga un papel más importante en el control del fenotipo de células TH9. El STAT6 suprime inducción del TGFβ y la expresión del FOXP3 y la expresión del factor de transcripción T-bet asociado a células Th1 (también conocido como TBX21), ambos reprimen la producción de IL-9. La IL-4 y el STAT6 también tienen un papel crucial en la inducción del programa de desarrollo de células TH9. Un trabajo reciente definió una firma de genes específicos TH9 que distingue las células TH9 de sus estrechamente relacionadas células TH2 y de sus homólogas células Treg derivadas in vitro (iTreg). De manera interesante, la mayoría de los genes que se enriquecieron en células TH9 fueron dependientes de STAT6, como los genes que codifican los factores de transcripción del factor 4 regulador de interferón (IRF4) y el factor de transcripción de cierre básico de leucina (BATF).
La expresión del IRF4 es crucial para la diferenciación de células TH9, además de su requisito previamente documentado para la diferenciación de las células TH2 y células TH17. Las células T secretoras de IL-9 disminuyeron en cultivos de células TH9 que se derivaron de células T vírgenes deficientes de IRF4 o a partir de células se trataron con el ARN pequeño de interferencia específico a IRF4 (siRNA). Por otra parte, la expresión ectópica del IRF4 aumenta la producción de IL-9 en cultivos de células TH9. El IRF4 se une de manera directa al promotor Il9 y aumentó la transcripción de Il9 en un reporte de ensayo, lo que sugiere que el IRF4 tiene un papel importante en la inducción directa de la transcripción del gen de la IL-9 en las células TH9. A pesar de su requerimiento para la expresión de Il9, el IRF4 sólo regula un subconjunto de otros genes asociados a células TH9. De manera interesante, la supresión del STAT6 o el IRF4 de células T resulta en una mayor expresión de T-bet e interferón-γ (IFN-γ), que suprimen el desarrollo de células TH9.
Por lo tanto, es probable que el IRF4 apoye el desarrollo de células TH9 al inducir de forma directa la transcripción de Il9, así como mediante el bloqueo de la expresión de los factores de transcripción asociados a las células TH1 que pueden inhibir la diferenciación de células TH9.
Además del IRF4, se requiere el BATF para el desarrollo de células TH9 y esto es paralelo a un requisito similar visto en la generación de células TH17, en la que el BATF y el IRF4 trabajan como un módulo transcripcional. Las células T CD4+ vírgenes aisladas de ratones que carecen de BATF muestran un deterioro marcado en la diferenciación de células TH9, y las células T CD4+ vírgenes en las que el BATF se expresó de forma ectópica o células T de animales transgénicos Batf mostraron una propensión incrementada para producir IL-9 cuando se cultivaron bajo condiciones de inducción de células TH9. De manera similar a IRF4, se demostró que el BATF se une al promotor Il9 y activa la transcripción de Il9 en reportes de ensayos. Sin embargo, en contraste con IRF4, que regula un número bastante pequeño de genes asociados a células TH9, la deficiencia de BATF resultó en un defecto marcado en la expresión de casi todos los genes asociados a células TH9 que se examinaron, lo que refleja las observaciones en las células T deficientes de STAT6. La diferencia entre los efectos de BATF y el IRF4 para alterar el alcance general de la firma del gen específico para células TH9 destaca que, aunque BATF y IRF4 pueden funcionar como un módulo transcripcional, es probable que BATF y IRF4 también proporcionen contribuciones únicas para establecer el fenotipo celular TH9.
Aunque la expresión de la proteína de unión GATA 3 (GATA3) es menor en las células TH9 que en las células TH2, es un importante gen diana STAT6 que está involucrado en la diferenciación de células TH9. Dardalhon y colaboradores mostraron que las células nulas para GATA3 no produjeron IL-9 cuando se cultivaron bajo condiciones de sesgo de células TH9 y que esto fue concomitante con el aumento de expresión de FOXP3 vinculado a una posible interacción física entre las proteínas de GATA3 y FOXP3. Sin embargo, aún no está clara la función de GATA3 en la diferenciación de células TH9, ya que algunos estudios detectaron poco mRNA Gata3 en células TH9 en comparación con células TH2, y la expresión ectópica de GATA3 en células TH9 aumentó la producción de IL-9 en algunos estudios, pero no en otros. Los resultados diferentes en estos estudios pueden reflejar la cantidad de GATA3 dentro de la célula. A pesar de la expresión de GATA3 en todas las células T, la expresión inducida de GATA3 podría reprimir la inducción de FOXP3 sin genes asociados que activan a las células TH2. En cantidades mayores, el GATA3 podría activar la expresión de los genes asociados a las células TH2 y podría reprimir la capacidad de PU.1 (un factor inductor de células TH9 discutido a continuación) para activar IL-9. Por lo tanto, un gradiente de expresión de GATA3 podría ser decisivo en el establecimiento de la identidad de múltiples subconjuntos de células TH.
Caja 1 |Proteínas STAT y subconjuntos de células TH
La diferenciación de células T CD4+ en células T cooperadoras (TH) se inicia cuando las células T CD4+ vírgenes son estimuladas por el antígeno en el contexto de las moléculas del CMH clase II y adquieren la capacidad de responder a un entorno de citocinas que promueve el desarrollo de fenotipos de células efectoras especializadas. La especialización o polarizado del subconjunto de células efectoras, denominado un subconjunto de células TH, se identifica por la producción de familia de citocinas y expresa una señal característica de transcripción. Los subconjuntos de TH polarizadas se desarrollan principalmente en respuesta a un entorno específico de citocinas, aunque la activación de la intensidad de la señal y las señales no provenientes de citocinas también afectan a la diferenciación. El ambiente de la citocina activa al transductor de señal y a los miembros de la familia del activador de transcripción (STAT), que inducen la expresión de genes específicos de linaje, modifican la arquitectura de cromatina local y establecen un perfil seguro de todo el genoma. Entre los genes activados por proteínas STAT son citocinas que confieren funciones específicas al subconjunto de células TH; receptores de quimiocinas y moléculas de adhesión que permiten que la célula T migre a sitios de inflamación; y la transcripción adicional de factores que funcionan para establecer aún más y mantener el patrón característico de la expresión génica. Las proteínas STAT, aunque transitoriamente activas, son puertas de entrada al proceso de diferenciación de las células TH y el primer paso en el camino al compromiso a un fenotipo específico de células TH.
STAT5 en el desarrollo celular TH9. El STAT5 afecta el desarrollo de varios factores extracelulares de la secuencia final de las células TH9. La IL-2 activa STAT5 en las células T y promueve el desarrollo de las células TH9. Las células T CD4+ deficientes de IL-2 muestran una pérdida completa de células secretoras de IL-9 in vitro, un hallazgo que se revisó 20 años después de su descubrimiento. En ambos informes, la adición exógena de IL-2 rescató la producción de IL-9 en las células T deficientes de IL-2 que se cultivaron en presencia de TGFβ solo o con IL-4. El papel de STAT5 en la producción de la IL-9 se demostró de forma directa por estudios en los que su eliminación en células TH9 cultivadas dio lugar a una disminución dramática en la producción de IL-9. Estos hallazgos se corroboraron por el uso de inhibidores de STAT5 y siRNAs dirigido contra Stat5 para bloquear la producción de IL-9 en las células T CD4+ vírgenes cultivadas bajo condiciones de sesgo para células TH9. Estos estudios mostraron una unión significativa de STAT5 dentro del promotor Il9 mediante inmunoprecipitación de la cromatina y demostraron que el STAT5 activo de forma constitutiva podría activar de manera directa el promotor Il9 en los reportes de ensayo. Además de los efectos directos sobre Il9, el STAT5 probablemente afecta otros componentes de la diferenciación de las células TH9. El bloqueo de IL-2 o la inhibición del STAT5 resultan en una disminución en la expresión de IRF4 y PU.1, ambos son factores de transcripción que se requieren para la diferenciación de células TH9. Además, la transmisión de señales de la vía IL-2-STAT5 se relaciona de manera estrecha con la proliferación y el metabolismo celular, que son procesos que también afectan a la diferenciación de células TH, y los enfoques para distinguir los efectos directos e indirectos de esta vía serían complejos.
Aunque la IL-2 es probablemente un activador primario de STAT5 en las células T, la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) también promueve la producción de IL-9 por células cultivadas bajo condiciones inducidas por células TH9, pero no bajo la inducción de células TH2. Las células TH9 expresan el receptor TSLP, que aumenta su expresión después de la estimulación por TSLP.  La TSLP también aumentó los niveles de STAT5 fosforilado durante el curso de la diferenciación de células TH9 y resultó en un incremento de la unión de STAT5 al locus Il9. Es importante destacar que, la inhibición de STAT5 por medio de siRNA invalidó la capacidad de la TSLP para aumentar la producción de IL-9 por las células TH9. De manera interesante, la TSLP era todavía capaz de aumentar la producción de IL-9 cuando la IL-2 se bloqueó con anticuerpos monoclonales en estos cultivos. Estos datos sugieren que la IL-2 y la TSLP pueden trabajar juntas para promover la producción de IL-9 en las células T, en particular in vivo, y que la TSLP podría sustituir a la IL-2 en algunas condiciones.
Hay factores adicionales que también inducen la producción de IL-9 al incrementar la producción de IL-2. El miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) la molécula relacionada al ligando 1α del TNF (TL1A; también conocida como TNFSF15) demostró aumentar la producción de IL-9 de manera independiente del STAT6 y PU.1, que son importantes para la generación in vitro e in vivo de las células TH9. La unión del receptor TL1A, el receptor 3 de muerte (DR3; también conocido como TNFRSF25), dio lugar a una mayor producción de IL-2 y activación de STAT5, que se requiere para la inducción de IL-9. El óxido nítrico también funciona al incrementar la producción endógena de IL-2 y la activación de STAT5. Por lo tanto, en algunos entornos, TL1A u óxido nítrico pueden aumentar la producción de IL-9 al activar la vía IL-2-STAT5.
El STAT5 también tiene amplios efectos en la programación de las células TH9. Los estudios encontraron que el bloqueo de la IL-2 o la inhibición de STAT5 resultan en un incremento en el ARNm y la expresión de proteínas del represor transcripcional del linfoma de células B 6 (BCL-6). El BCL-6 se identificó de manera original como un protooncogén en los linfomas de células B y más tarde se demostró que era un regulador primario de transcripción de células T CD4+ cooperadoras foliculares (TFH). Las células TH9 muestran niveles más bajos de expresión de BCL6 que otras células TH generadas in vitro, y la expresión de BCL6 correlaciona de manera inversa con los niveles de Il9 y mRNA en las células TH9. Además, se mostró que la expresión mediada por retrovirus de BCL-6 en las células TH9 inhibe la diferenciación células TH9 y la transcripción de Il9 inducida por la IL-2, aunque sólo un informe mostró un aumento en la producción de la IL-9 por las células T que tuvieron expresión disminuida de BCL-6. Sin embargo, ambos estudios mostraron que el BCL-6 se une al promotor Il9 en regiones en superposición o adyacentes a STAT5 y reprime la capacidad de STAT5 para promover la transcripción de Il9 en reportes de ensayo. Estos datos sugieren un circuito molecular en el cual la producción temprana de IL-2 activa la unión del STAT5 al promotor Il9, lo cual supera la unión de BCL-6 al promotor, y reprime la expresión de BCL6. Ya que declinan la exposición de IL-2 y la activación de STAT5, disminuye la supresión de la actividad de BCL-6 mediada por STAT5 y el BCL-6 tiene un mejor acceso al promotor Il9, que de forma subsecuente limita la producción de IL-9.
STAT1 en el desarrollo celular de TH9. El STAT1 se activa en las células T por varias citocinas, como IFNγ, INF tipo I, IL-6, IL-10, IL-21 e IL-27. Cada uno de estos citocinas tiene diferentes influencias en el desarrollo de células TH9. La activación de STAT1 al tratar células T vírgenes de ratones cultivadas en condiciones de inducción de células TH9 con IFNγ reprime de manera notable la producción de IL-9 al reducir la sensibilidad de estas células para la IL-4. En un modelo de asma, la deficiencia en el receptor diferente de proteína tirosina cinasa 2 (TYK2), la cinasa Janus que se requiere para la transmisión de señales del IFN tipo I y la activación de STAT1, resultó en un aumento en la producción de IL-9. En un sistema de modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), el IFNγ indujo la producción de IL-27 por células dendríticas (DC), que suprimieron la diferenciación celular TH9 tanto in vivo como in vitro en una manera dependiente de STAT1 y dependiente de T-bet. Aunque el tratamiento de células TH9 con IL-27 indujo la producción de IFNγ e IL-10, que son citocinas que suprimen la diferenciación de células TH9, la inhibición de la producción de IL-9 por IL-27 fue independiente de estas citocinas. Se debe llevar a cabo trabajo adicional con el fin de entender cómo las funciones de secuencia final de STAT1 del IFNγ y la IL-27 suprimen la producción de IL-9 en células TH 9.
En contraste con el efecto inhibidor de STAT1 en la diferenciación de la célula TH9 posterior a la exposición a IFN o IL-27, otros informes sugieren que un subconjunto distinto de citocinas activadoras de STAT1 puede promover la producción de IL-9 en las células T. Las células T CD4+ vírgenes humanas que se cultivaron bajo condiciones de inducción de células TH9 con las citocinas de activación de STAT1 IFNα, IFNß, IL-6 o IL-21 mostraron un aumento marcado en su capacidad de producir IL-9. Del mismo modo, el tratamiento de cultivos de células TH9 de ratón con IL-1β resultó en la activación indirecta de STAT1, que indujo a expresión de IRF1; el IRF1 se unió de forma posterior al promotor Il9 y, en combinación con IRF4 y PU.1, mejoró de manera directa la transcripción de IL-9 en un reporte de ensayo. También se demostró que la IL-21 puede tener tantos efectos positivos o negativos en la producción de IL-9, según las condiciones de cultivo. Así, los efectos de las citocinas activadoras de STAT1 en el desarrollo de células TH9 son complejos y controlados por señales de citocinas adicionales que están presentes en el medio ambiente.
TGF y transmisión de señales de SMAD en el desarrollo de células TH9. Los estudios demostraron que el TGFβ puede “reprogramar” las células TH2 en células TH9 secretoras de IL-9. Aunque todavía por definir en las células TH9, las vías dependientes de SMAD y las vías independientes de SMAD se requieren para la diferenciación de las células Treg y TH17. Wang et al y Tamiya et al mostraron que SMAD2, y SMAD3 y SMAD4 son necesarios para la óptima diferenciación de células TH9. La deficiencia de SMAD2 o SMAD4 en las células T resulta en incremento de la expresión de los genes que codifican citocinas asociadas a células TH2 y en una pérdida de la expresión de IL-9. El SMAD2 y SMAD3 se unen a múltiples regiones conservadas no codificantes dentro del promotor Il9, y SMAD2, SMAD3 y SMAD4 también demostraron alterar la estructura de la cromatina del locus Il9. Sin embargo, estos informes describen mecanismos distintos para la actividad SMAD. Wang et al observaron un aumento en las marcas represivas de histonas en el promotor Il9 en ausencia de SMAD2 o SMAD4, como un resultado de una proteína incrementada Polycomb (potenciador de zeste homólogo 2 [EZH2]) de reclutamiento del promotor Il9. Por el contrario, Tamiya et al mostraron una pérdida de marcas permisivas de histona en ausencia de SMAD2 y SMAD3, y no mostraron cambios en las marcas represivas. De manera interesante, la vía SMAD podría también proporcionar un enlace a otras vías de inducción de células TH9. Se requieren proteínas Notch para la unión de SMAD3 al gen Il9. Por otra parte, SMAD2 o SMAD3 pueden formar un complejo físico con IRF4, y IRF4 y SMADs se requieren de manera recíproca para la unión óptima al promotor Il9. También se requirió de IRF4 para la transcripción de Il9 mediada por SMAD en un reporte de ensayo. Estos datos proporcionan las bases de un modelo que podría utilizarse para explicar cómo la activación de IRF4 inducida por IL-4-STAT6 y la activación de SMAD conducida por TGFβ trabajan juntas para transactivar el gen Il9.
El PU.1 es un factor de transcripción de la familia ETS que también es inducido por TGFβ en conjunto con la estimulación del receptor de antígeno y es crucial para la diferenciación de las células TH9. Las células T CD4+ deficientes de PU.1 tienen una capacidad disminuida para producir IL-9 y una mayor propensión para producir citocinas relacionados con las células TH2, mientras que la expresión ectópica de PU.1 en las células TH2 o las células TH9 aumenta la producción de IL-9. Por lo tanto, PU.1 está tan lejos de ser el único factor de transcripción que induce la producción de IL-9 en otros subconjuntos de células TH. De manera similar a los otros factores descritos de forma previa, PU.1 se une al promotor de IL-9 y probablemente aumenta la transcripción de genes mediante el reclutamiento de acetiltransferasas de histonas (HATs) y mediante la promoción de estructuras permisivas de cromatina. De manera interesante, el PU.1 es uno de los pocos genes que no es inducido por la transmisión de señales de IL-4-STAT6 en las células TH9, sino que está inducido por la secuencia final de la transmisión de señales de TGFβ. Los estudios que compararon células T deficientes de SMAD y las de tipo salvaje que se cultivaron bajo condiciones de inducción de células TH9 no encontraron diferencias observables en la expresión del gen Sfpi1 que codifica para PU.1, lo que sugiere que el PU.1 puede estar regulado por mecanismos de transmisión de señales inducidos por TGFβ independientes de SMAD.
En resumen, el desarrollo de las células TH9 implica la función coordinada de los principales factores de transcripción de la secuencia final de IL-4-STAT6 y la transmisión de señales de IL-2-STAT5, como IRF4 y BATF. Además, las proteínas SMAD inducidas por el TGFβ y la inducción de PU.1 independiente de SMAD son necesarias para generar células T secretoras de IL-9. Estas vías convergen en la capacidad de IRF4 para interactuar con BATF y las proteínas SMAD. Todavía no está claro cómo estos factores contribuyen a la estabilidad del fenotipo TH9. El resultado de la actividad de estos factores de transcripción en relación con la función de las células TH y se discute en las siguientes secciones, y se centra en el papel de las células TH9 en la enfermedad inflamatoria y la inmunidad.
Caja 2 |Distinguir la expresión aguda de una citocina y el compromiso a un subconjunto de células T cooperadoras (TH)
A menudo, un subconjunto de células T cooperadoras (TH) se identifica sólo por la expresión de una citocina distintiva, que por lo general se evalúa después de la estimulación de la célula con la unión del receptor de células T o activadores farmacológicos sustitutos, como el acetato de forbol miristato (PMA) y la ionomicina. Esta estimulación resulta en la activación aguda de un locus particular de citocinas (o loci) que está programado o a punto de ser expresado después de la estimulación. Entre los factores activados por estas vías están el factor nuclear de células T activadas (NFAT) y los miembros de la familia del factor nuclear-κB (NF-κB) que, en el caso de las células TH9, pueden unirse de manera directa al locus de la interleucina-9 (Il9). Además del receptor de unión de células T, varios otros ligandos pueden inducir la producción de IL-9 por medio de mecanismos que se probó, o que es probable, que requieran de los miembros de la familia NF-kB, como OX40 y otros miembros de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), IL-1 y miembros de familias relacionadas, e IL-25. Los detalles de los miembros de la familia NF-κB en estas vías coestimuladoras de IL-9 se revisaron de manera reciente.
Los efectos de los ligandos que inducen en forma aguda la producción de IL-9 son probablemente distintos de aquellos responsables de la programación del locus Il9, que requiere muchos de los factores de transcripción que se describen en detalle en la presente revisión, como el transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5), STAT6, PU.1, el factor de transcripción de cierre de leucina básica (BATF), el factor regulador de interferón-4 (IRF4) y las proteínas SMAD. Estos factores de transcripción que promueven subtipos inducen genes distintos de Il9 e inician cambios en la estructura de la cromatina que son característicos de células diferenciadas. Sin embargo, es difícil examinar el compromiso de las células T al fenotipo que secreta IL-9 debido a que el fenotipo de células TH9 parece ser transitorio in vitro y en algunos modelos de enfermedad autoinmune. A pesar de estas observaciones, las células T productoras de IL-9 se identificaron en modelos sanos y enfermos de piel humana, y en varios modelos de enfermedad en ratones. Por otra parte, células T IL-9+, que son negativas para otras citocinas (como IL-13 e interferón-γ [IFN]), se observaron en muestras de pacientes ex vivo. La transferencia adoptiva de células TH9 derivadas in vitro mostraron función efectora dependiente de IL-9 en inflamación pulmonar alérgica. Por lo tanto, existe considerable evidencia de la estabilidad in vivo del fenotipo de células TH9 y es posible que la incapacidad para examinar la estabilidad del subtipo de células TH9 in vitro es un resultado de las limitaciones técnicas de los sistemas de cultivo actuales.
Células TH9 en inmunidad y enfermedad. Ya que la IL-9 es una citocina pleiotrópica (Caja 3), las células TH9 podrían contribuir tanto a la inmunidad protectora y enfermedad inmunopatológica por medio de numerosas vías. Sin embargo, es importante recordar que las células TH9 no son la única fuente de IL-9 durante una respuesta inmune y, en consecuencia, la importancia relativa de las células TH9 in vivo es difícil de definir. En el resto de esta revisión, se discuten los conocimientos actuales de la actividad inmune celular TH9 en enfermedades específicas con datos de pacientes humanos. También se describe la investigación experimental complementaria en modelos de enfermedad en ratones que apoya la idea de que la inflamación mediada por células TH9 tiene un papel en las enfermedades humanas (Fig. 3).
Caja 3 | Interleucina-9: fuentes y funciones
Aunque esta revisión se centra en las células T cooperadoras 9 (TH9), hay otras fuentes de la interleucina-9 (IL-9) dentro del sistema inmunológico. Las células linfoides innatas tipo 2 (ILC2s) producen de manera potente IL-9 en ratones estimulados con papaína y parásitos helmintos, así como después de la estimulación in vitro con IL-2. Los mastocitos también producen IL-9 en respuesta a los receptores tipo Toll (TLR) y las señales de citocinas. Las células T CD8+ pueden adquirir un fenotipo productor de IL-9, y estas células se denominan como células “TC9”. Las células T asesinas naturales (NKT) expresan IL-9 en modelos de inflamación alérgica y autoinmune. Se reporta que otras células T CD4+ –como TH2, TH17 y las células T reguladoras (Treg)– producen IL-9, aunque las cantidades de IL-9 producidas por cada uno de estos tipos de células por lo general son menores que las producidas por una célula TH9. Se necesita trabajo adicional para definir de manera completa los niveles de IL-9 que se producen por estos tipos de células y la contribución de cada tipo de célula durante diferentes respuestas inmunes.
La IL-9, de manera similar a muchas citocinas, tiene una función pleiotrópica. En las células hematopoyéticas, la IL-9 transmite señales por medio de una cadena específica del receptor de la IL-9 (IL-9Rα) y la cadena común γ (γc, también conocida como IL-2Rγ), que es compartida con el receptor para las citocinas relacionadas, como IL-2, IL-4 e IL-21. La IL-9 promueve el crecimiento de mastocitos y células T, estimula la acumulación de mastocitos en los tejidos, promueve la supervivencia de las ILC, mejora el cambio de clase a IgE en las células B y altera la actividad de las células progenitoras hematopoyéticas. Aunque algunas funciones in vivo de la IL-9 requieren de la producción de citocinas tipo TH2, la IL-9 puede promover la diferenciación de las células que secretan IL-17 in vitro. El IL-9Rα también se expresa en las células no hematopoyéticas, como las células epiteliales de las vías respiratorias e intestinales, células musculares lisas y queratinocitos. Aún no se define si hay requerimiento de transmisión adicional de señales para la función de IL-9 en las células no hematopoyéticas. La IL-9 estimula la producción de quimiocinas de todos estos tipos de células, aumenta la producción de moco de las células epiteliales de las vías respiratorias y altera la función de la barrera de las células epiteliales intestinales. Por lo tanto, la IL-9 es significativa en la capacidad de muchas células para regular la inflamación y la inmunidad al afectar muchos tipos de células.
Células TH9 en la enfermedad atópica. Las enfermedades atópicas, como la dermatitis atópica y el asma, se asocian con respuestas de citocinas tipo TH2 e hipersensibilidad inmediata mediada por IgE. Los informes identificaron de manera reciente a las células TH9 como principales contribuyentes a la enfermedad atópica humana. Los genes relacionados con el desarrollo y la función de las células TH9 (por ejemplo, IL4RA, STAT6, IL9, IL9R, SMAD3, IL33, receptor tipo 1 de la IL-1[IL1RL1]) se asocian con el desarrollo de asma y alergias alimentarias en humanos. Los pacientes con alergia tienden a tener un mayor número de células T circulantes que son capaces de producir IL-9 en respuesta al polen, caspa de gato, cacahuates y ácaros del polvo doméstico (HDM) que los individuos control, y las DCs aisladas de estos pacientes fueron más propensas a estimular la producción de IL-9 de las células T. Además, las células T productoras de IL-9 de pacientes con atopia expresaron las proteínas relacionadas con las células TH9 IL-17RB, IRF4 y PU.1; pero no expresaron la citocinas tipo TH2 IL-5. El número de las células TH9 y los niveles séricos de IL-9 en los individuos con atopia correlacionan de manera directa con los títulos de IgE específica al alérgeno. Además, el número de células TH9 y la producción de IL-9 por las células T se incrementan de manera significativa con respecto a individuos control en niños con atopia y en pacientes con dermatitis atópica y psoriasis.
En modelos de ratón con asma (en los que se utilizan como sensibilizadores el extracto de HDM, Aspergillus fumigatus u ovoalbúmina [OVA]), las células TH9 son detectables en el tracto respiratorio y en el drenaje los ganglios linfáticos, en particular durante las primeras etapas de la enfermedad. En el modelo de sensibilización por OVA, las células TH9 son una fuente principal in vivo de IL-9 durante la enfermedad alérgica de las vías respiratorias, como se determina por un modelo de IL-9de muerte de ratón. Las células TH9 y los niveles de IL-9 en estos modelos se incrementaron cuando las citocinas proalérgicas IL-25 y TSLP (Tabla 2) se expresaron de manera ectópica o exógena, y la IL-9 se inhibió por la actividad de la ciclooxigenasa 2, que puede disminuir la expresión de IL-25R. Además, la inhibición de la diferenciación de células TH9 in vivo mediante la neutralización de TGFβ o activina A –que es un miembro de la familia del TGF que también induce la diferenciación de las células TH9– perjudica el desarrollo de la enfermedad alérgica. Por otra parte, la inflamación se atenúa en ratones con deficiencias condicionales en PU.1 e IRF4 o en ratones con deficiencias en la línea germinal en BATF. Es importante destacar que los ratones deficientes de PU.1, que tienen más defectos específicos en el desarrollo de las células TH9, tienen respuestas normales de las células TH2, pero aún no desarrollan inflamación grave en los modelos de sensibilización a OVA.
Los modelos de ratón con enfermedad atópica indican que las células TH9 median la enfermedad mediante la producción de IL-9. La transferencia adoptiva de células TH9 promueve la acumulación de mastocitos y eosinófilos, la producción de moco, la producción de citocinas tipo TH2 y la hiperreactividad bronquial. Sin embargo, estos efectos son negados después de la transferencia de células TH9 Il9-/- o después de la neutralización de la IL-9. Además, la transferencia adoptiva de células TH9 promueve una mayor acumulación de mastocitos que la transferencia de células TH2, y esto es dependiente de la IL-9, pero no de la IL-13. En un modelo de asma inducida por HDM que requiere una respuesta endógena de células T, la neutralización de la IL-9 o la deficiencia de PU.1 dentro del compartimento de las células T reduce de manera significativa la hiperplasia de moco, la acumulación de mastocitos, la remodelación pulmonar y la hiperreactividad de las vías aéreas. La IL-9 estimula la proliferación de mastocitos y la actividad in vivo y puede promover la producción de citocinas por células linfoides innatas tipo 2 (ILC2s). Además, la expresión transgénica de IL-9 es suficiente en sí misma para causar respuestas de hiperreactividad bronquial por medio de sus efectos en el epitelio respiratorio y el aumento de la liberación de citocinas tipo TH2. En conjunto, estos modelos indican que, aunque otras células pueden producir IL-9, las células TH9 son cruciales en un conjunto diverso de modelos de enfermedad pulmonar atópica, tienen un papel distinto en el desarrollo de la enfermedad atópica del de las respuestas inmunes de las células TH2 y son suficientes para generar inflamación alérgica en modelos de transferencia.
Las células TH9 en la EII. La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa son las formas principales de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que se define como una inflamación crónica recidivante del tracto gastrointestinal que es independiente de la infección específica por patógenos. El paciente con enfermedad de Crohn tiene una respuesta inmune tipo TH1 pronunciada (asociada con producción de IFN y TNF), mientras que los pacientes con colitis ulcerosa tienen niveles elevados de citocinas derivadas de células TH2. En ambas enfermedades, los pacientes mostraron aumento en el número de células TH17 y menos células Treg.
De manera reciente, también se encontró que las células TH9 tienen un papel crucial en la patogénesis de la EII. Los pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa que mostraron inflamación en curso tuvieron un número elevado de células CD4+PU.1+ y células T CD4+IRF4+ dentro del tracto gastrointestinal al compararse con los pacientes de control o los pacientes en remisión. De manera interesante, la producción de IL-9 por estas células sólo se observó en pacientes con colitis ulcerosa, y hubo una asociación de expresión de Il9 y células T IL-9+ con la gravedad de patología.
En modelos de ratón de EII, la cotransferencia de células T CD4+ CD45RBhi y en células TH9 derivadas in vitro en huéspedes deficientes del gen de activación-recombinación (RAG) dio lugar a un mayor desarrollo de colitis en comparación con los animales control que recibieron células T CD4+ CD45RBhi T solas, por medio de un mecanismo que fue dependiente de IL-9. En un modelo de colitis inducida por oxazolona, los ratones deficientes de IRF4 e IL-9 tuvieron puntajes de colitis significativamente menores. El efecto de la deficiencia de IRF4 en la colitis se debe al menos de manera parcial a la reducción la respuesta de células TH17. Sin embargo, el hecho de que la colitis atenuada se ve en ratones que carecen de la expresión de PU.1 en las células T indica que las células TH9 también son importantes en el desarrollo de colitis. En estos experimentos, la capacidad de las células TH9 para mediar la colitis demostró ser dependiente de IL-9, así ya que las células deficientes de IL-9 y la neutralización de la IL-9 atenuaron la colitis. La expresión de IL-9R también se elevó en las células epiteliales gastrointestinales en pacientes con colitis ulcerosa. El tratamiento de células Caco-2, que son una línea celular epitelial humana, con IL-9 demostró inhibir la proliferación celular. Gerlach et al no sólo fundamentaron el efecto negativo de la IL-9 en la proliferación celular epitelial, también señalaron que la administración tópica de IL-9 recombinante atenuó los mecanismos de reparación tisular de las células epiteliales in vivo. Además, la IL-9 aumentó la permeabilidad intestinal, que puede ser un resultado de IL-9 que altera la composición de la proteína de unión estrecha en las células epiteliales gastrointestinales. En conjunto, estos resultados indican que las células TH9 y la IL-9 alteran de manera directa la biología de las células epiteliales dentro del tracto gastrointestinal, y de manera potencial contribuyen a la patología de la EII. No está claro si las células TH9 contribuyen a la colitis principalmente por medio de efectos sobre las células epiteliales o mediante efectos sobre el sistema inmunológico. Sin embargo, algunos efectos de la IL-9 en células epiteliales pueden ser indirectos, como los sugieren los efectos dependientes de los mastocitos en un modelo de anafilaxia inducida por antígenos.
Es interesante observar que, la IL-9 atenúa el desarrollo de la enfermedad en un modelo de colitis mediada por células TH1 que comparte algunas de las características de la enfermedad de Crohn. El papel de las células TH9 en este modelo de enfermedad queda por investigar, aunque los investigadores mostraron que las células T NK eran una fuente principal de IL-9. Aunque la producción de IL-9 derivada de células NKT parece limitarse en pacientes con colitis ulcerosa, quizá el papel de la IL-9, y de las células de TH9 en sí mismas, puede ser protector o inflamatorio en el tracto gastrointestinal de acuerdo al medio inflamatorio.
Células TH9 en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). La EAE en un modelo experimental animal de esclerosis múltiple que se caracteriza por la desmielinización dependiente de células T. La EAE se asocia con respuestas de células TH1 y TH17, y las células TH17 se identificaron en el sistema nervioso central (CNS) de pacientes con esclerosis múltiple. Las células TH9 están presentes en el drenaje de los ganglios linfáticos y el CNS de ratones a los que se administró el péptido de la proteína proteolipídica de la mielina PLP para inducir la EAE, y la transferencia adoptiva de células T específicas para la glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) cultivadas bajo condiciones inducidas por células TH9 en ratones deficientes de RAG promovieron EAE. Aunque la EAE mediada por células TH9 no es tan grave como la EAE inducida por células TH17, la transferencia adoptiva de células TH9 puede desencadenar la neuropatía periférica que no es tan aparente en receptores de células TH1 o células TH17.
La EAE mediada por células TH9 es dependiente de la IL-9, la cual tiene un papel bien documentado en la patogénesis de la EAE debido a su capacidad para mejorar las respuestas inmunes de las células TH1 y las células TH17 durante la progresión de la enfermedad. Por el contrario, otros estudios sugirieron que la IL-9 también puede tener un efecto de protección antes de la inducción de EAE, posiblemente mediante al incrementar la actividad de las células Treg. Para complicar aún más la interpretación de estos estudios, subsecuente a la transferencia adoptiva en un modelo de EAE, muchas células TH9 adquieren la capacidad para producir IFNγ e IL-17, y la adquisición de la producción de IFNγ promueve en parte la gravedad de la EAE. Esto en paralelo a las observaciones de un modelo de uveítis autoinmune. Por otra parte, no está claro en los modelos de transferencia no adoptiva de células T si la fuente celular de la IL-9 son las células TH9 u otro tipo celular como las células TH17. Se requerirá el uso posterior de modelos de transferencia no adoptiva para validar el papel de las células TH9 en la EAE y en última instancia para definir su papel en la esclerosis múltiple.
Células TH9 en infecciones por helmintos. Las infecciones por parásitos helmintos afectan a más de 1 billón de personas en todo el mundo, y se documentó que las células TH exacerban o limitan la patología. Las células TH9 circulantes específicas al antígeno se detectaron en individuos con filariasis linfática, que es una infección crónica por helmintos. En un modelo de infección de Trichuris muris, los ratones con una deficiencia restringida del receptor TGFβ tipo 2 (TGFβR2) de las células T CD4+ tienen reducción de los niveles de IL-9, disminución en el número de mastocitos y un aumento significativo en la carga de gusanos en comparación con los controles, lo que indica que las células TH9 pueden ser importantes en inmunidad a los helmintos. Las células TH9, pero no las células TH2, son capaces de reducir la carga de helmintos Nippostrongylus brasiliensis después de la transferencia adoptiva en huéspedes deficientes de RAC. En este modelo, las células TH9 transfieren números incrementados de eosinófilos, basófilos y mastocitos infiltrantes. Además, las células TH9 aumentan los números y la actividad de las ILC2, lo que puede ser debido al efecto de la IL-9 en la promoción de la supervivencia de las ILC2 in vivo.
En el paradigma actual, las células TH9 median la inmunidad antihelmintos por medio de la producción local o sistémica de IL-9. Durante las infecciones por T. muris y N. brasiliensis, la IL-9 se requiere para la expulsión del gusano y la expresión transgénica de la citocina mejora la resistencia a la infección por T. muris. Durante la infección por Trichinella spiralis, la IL-9 facilita, pero no es esencial, para generar la expulsión del gusano. En este modelo, la IL-9 modula la contracción muscular intestinal y la producción de moco de las células epiteliales, así como la actividad de los mastocitos, que, en particular, se requieren para la expulsión del gusano mediada por IL-9.
Las contribuciones relativas de las células TH9 y las ILC2s a la producción sistémica de IL-9 en las infecciones por helmintos todavía no están claras. En reportes de muerte de ratones por IL-9 con infección pulmonar por N. brasiliensis, la IL-9 demostró derivarse de ILC2s que de forma previa demostraron ser una fuente de IL-9 en un modelo de asma independiente de células T. Por el contrario, al usar reportes transcripcionales de ratones, Licona- Limon et al observaron que las células T CD4+ eran los principales productores de IL-9 en el tracto gastrointestinal en una modelo similar de infección de N. brasiliensis. Además, la transferencia de células TH9 en ratones Il9-/- rescató cualquier defecto asociado con la expulsión del gusano. Así, las células TH9 son probablemente una fuente principal de IL-9 protectora en ciertas infecciones por helmintos. Sin embargo, la IL-9 puede no ser esencial para la protección en todas las infecciones por helmintos e incluso puede ser perjudicial para la salud del huésped ya que los números de las células TH9 específicas al parásito correlacionaron de manera positiva con la gravedad de la enfermedad en personas que sufren de filariasis linfática.
Células TH9 en la inmunidad tumoral. Una función intrigante de las células TH9 es su actividad antitumoral muy potente, en particular en el melanoma. El número de células TH9 en la sangre y la piel se reduce de manera significativa en los pacientes con melanoma en comparación con individuados sanos, y un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de Il9 se asocia con un riesgo mayor de melanoma cutáneo maligno. En los modelos de melanoma B16-F10, varios laboratorios demostraron que la transferencia adoptiva de las células TH9 reduce de manera notable las masas tumorales y la gravedad de enfermedad en comparación con los controles. Mediante la administración de anticuerpos neutralizantes o proteínas recombinantes, los investigadores demostraron que la IL-9 tiene efectos antitumorales potentes en un modelo de melanoma de ratón. Además, las células TH9 y la IL-9 son protectores en un modelo adenocarcinoma de pulmón, lo que indica que las células TH9 pueden tener propiedades antitumorales en varios tejidos.
Aunque hay informes contradictorios que indican que las células TH9 pueden inducir de manera directa la muerte de las células tumorales, la capacidad de las células TH9 para limitar el crecimiento del tumor parece ser que depende principalmente de la producción de citocinas–como la IL-3, la IL-9 y la IL-2–para mejorar el desarrollo y la inmunidad tumoral existente. La IL-9 puede inducir la expresión del ligando 20 de quimiocina CC-20 (CCL20) en el sitio tumoral y la expresión del receptor 6 de quimiocinas CC (CCR6) en los leucocitos para facilitar la infiltración tumoral y el rechazo. Además, la actividad antitumoral de la IL-9 es dependiente de mastocitos. Las células TH9 también son potentes productores de IL-3 después de la estimulación de TCR. La IL-3 derivada de células TH9 demostró promover la supervivencia de las DC, que podría de manera potencial mejorar la inmunidad antitumoral. Végran et al mostraron de manera reciente que la IL-21 derivada de células Th9 inhibió el crecimiento de tumor incluso en ausencia de la producción de IL-9. En un entorno in vitro, las células TH9 pueden producir cantidades de IL-21 que son comparables a las de las células TH17 después de la estimulación de TCR, y Végran et al mostraron que IL-1ß incrementa la producción de las células TH9 de IL-21 para inhibir el crecimiento del tumor, en parte al incrementar las respuestas de células T CD8+ y la producción de IFNγ. Ya que la IL-1β también podría aumentar la producción de IL-9, el microambiente antitumoral podría además amplificar las respuestas inmunes de las células TH9 y por lo tanto la inmunidad antitumoral.
Los efectos protectores de las células TH9 en la inmunidad tumoral podrían restringirse a los tumores sólidos, tales como melanoma y adenocarcinoma de pulmón. La IL-9 se relaciona con la promoción de ciertos tipos de cáncer, en particular linfomas. La IL-9 se expresa en gran manera en un subconjunto de pacientes con linfoma anaplásico y enfermedad de Hodgkin.
La expresión transgénica de Il9 promueve el desarrollo de linfomas espontáneos en ratones, y en un modelo de ratón de Linfoma T linfoblástico, la IL-9 puede mejorar el desarrollo del tumor. Los estudios in vitro indican que la IL-9 promueve el crecimiento del tumoral al incrementar la proliferación e inhibir la apoptosis de las células tumorales. No está claro si las células TH9 son una fuente relevante de IL-9 durante el desarrollo del linfoma, pero puede indicar que las células TH9 pueden ser protumorigénicas y antitumorales según el tipo de cáncer. La base para la IL-9, y de manera potencial las células TH9, para tener efectos discriminatorios en diferentes tipos de cáncer está sin explorar, pero podría estar relacionado a la expresión diferencial del IL-9R en el tipo de cáncer.
Observaciones finales
Las señales de transmisión de TGFβ y de IL-4 promueven la diferenciación de las células TH9, pero ninguna citocina es suficiente por sí misma para generar el perfil transcripcional de las células TH9 o para inducir cantidades elevadas de expresión de IL-9 en las células T. Entre los factores de transcripción que responden a estas señales de citocinas, ninguno puede considerarse como “maestro regulador” de la misma de manera que T-bet, GATA3 o FOXP3 se pueden asociar con sus respectivos linajes de células TH. Sin embargo, es todavía posible que haya un factor de transcripción no identificado que defina el linaje de las células TH9. Otra posibilidad es que estas señales de transmisión de citocinas trabajen de manera cooperativa para promover la expresión del gen Il9. Las proteínas SMADs inducidas por TGFβ y PU.1 remodelan la cromatina y podrían funcionar para permitir los factores de transcripción inducidos por IL-4 BATF e IRF4 para transactivar la expresión génica. Como se indicó en la descripción previa, existe cooperación en el nivel de inducir la transcripción, y los factores activados por ambas señales son probablemente fundamentales en el reclutamiento de la polimerasa del ARN para elegir el loci y para cooperar en la generación del fenotipo y la función del subtipo de células TH9.
La comprensión de la biología de las células TH9 se desarrolla de forma rápida en múltiples enfermedades humanas y modelos de enfermedad de ratón. Se vuelve claro que, como es el caso con muchos otros subtipos de células TH, las células TH9 pueden tener tanto funciones beneficiosas como perjudiciales en el cuerpo. Dónde median estos efectos no está del todo claro, pero algunos paradigmas emergentes sugieren que las células TH9 se encuentran en la piel y que expresan receptores que facilitarían el reclutamiento a las superficies mucosas. Entre los efectos beneficiosos de las células TH9 es su capacidad para iniciar la inmunidad a los parásitos helmintos y la inmunidad antitumoral eficaz. En contraste, las células TH9 promueven la inflamación alérgica y median algunos tipos de autoinmunidad. Estas funciones plantean las preguntas de los casos en los que podrían ser útiles las terapias dirigidas a las células TH9 o a la IL-9. El MEDI-528 (también conocido como enokizumab), que es un anticuerpo humanizado neutralizante de IL-9, tiene un perfil de seguridad aceptable y muestra alguna promesa en la reducción de las exacerbaciones en pacientes adultos con asma leve a moderada, aunque no se observaron efectos positivos en adultos con asma grave. La discrepancia en los efectos del tratamiento podría estar en los subtipos de asma estudiados; es posible que el grupo con asma leve a moderada tenía enfermedad que podría ser más dependiente de la función de IL-9como un requerimiento para los mastocitos en las exacerbaciones de la enfermedad. No se reportó la elección como blanco de la IL-9 en otras enfermedades alérgicas. Ya que se observan aumentos de los niveles de IL-9 en una población atópica de lactantes y los aumentos se asocian con cambios tempranos en la respuesta de las vías respiratorias, un perfil de seguridad aceptable podría proporcionar una base para la intervención temprana en los recién nacidos de alto riesgo para limitar el desarrollo de enfermedades atópicas. Las descripciones recientes de las células TH9 en la EII sugieren que la elección como blanco de la IL-9 podría ser un tratamiento potencial en esta enfermedad. Por lo tanto, incluso con la poca comprensión de su desarrollo y función, las células TH9 se revelan para ser mediadores importantes en múltiples enfermedades, tanto las células como las citocinas que producen persisten como objetivos interesantes para la terapia.
Logo of nihpaAbout Author manuscriptsSubmit a manuscriptHHS Public Access; Author Manuscript; Accepted for publication in peer reviewed journal;
Nat Rev Immunol. Author manuscript; available in PMC 2016 May 1.
Published in final edited form as:
Published online 2015 Apr 7. doi:  10.1038/nri3824
PMCID: PMC4445728
NIHMSID: NIHMS688233

The Development and in vivo function of TH9 cells

Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México

Dra. med. Sandra Nora González Díaz        Jefe y Profesor
Dr. José Ignacio Canseco Villarreal             Profesor
Dra. Alma Belén Partida Ortega                  Residente 2° Año

Dra. Alejandra Macías Weinmann               Profesor

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