La dermatitis atópica (DA) es la enfermedad inflamatoria crónica de la piel más común. El prurito crónico es su síntoma distintivo y ejerce una carga grave en muchas áreas del funcionamiento de los pacientes. El prurito en la DA es diferente al de otras dermatosis, ya que de manera frecuente involucra la piel no lesionada y a menudo se generaliza. Además, el prurito en la DA de forma frecuente precede la exacerbación episódica del eccema, en línea con la definición de Engman de eccema atópico como “picazón que erupciona, no una erupción que pica”.
Los autores de este estudio y otros demostraron de manera previa que la provocación de la piel con DA con Mucuna pruriens, que induce respuestas de prurito similares a las de la DA, conduce a prurito de larga duración. Posibles explicaciones incluyen la sensibilización central y la sobreexpresión del receptor activado por proteasas 2 (PAR-2) en la piel con DA, lo que se correlaciona con un aumento del prurito tras la inyección del agonista de PAR-2 SLIGKV-NH2.
Además, se demostró de manera reciente que también la piel no lesionada en la DA muestra anomalías en sus funciones inmunitarias, como el aumento de expresión de los mediadores relacionados con las células T reguladoras y la disfunción de los genes relacionados con Th2/22/17, así como la disfunción de la barrera, es decir, una diferenciación terminal alterada de los queratinocitos, en comparación con la piel sana.La respuesta de prurito se acompaña de inflamación neurogénica, que se manifiesta como eritema cutáneo visible debido al aumento del flujo sanguíneo. Esto es el resultado de la transducción antidrómica de señales y la liberación de mediadores inflamatorios y vasodilatadores de las neuronas aferentes. La reacción de eritema es notable de manera particular en el prurito inducido por histamina, de forma principal debido a las áreas extensas de inervación de las fibras C mecanosensibles e insensibles a la histamina. De forma previa, tanto los autores de este trabajo como otros demostraron que la respuesta de eritema en la DA está desregulada.
Hasta ahora, no está claro si la sensibilización al prurito de la piel no lesionada es específica de la DA o si también ocurre en otras dermatosis inflamatorias crónicas, y qué mecanismos subyacen a este fenómeno.
Por lo tanto, se investigó la sensibilidad al prurito inducido por Mucuna pruriens e histamina en la DA y se comparó con otras dermatosis inflamatorias crónicas y pruriginosas más comunes, de etiologías variadas, que presentaron diferentes características de prurito, como la urticaria crónica espontánea (UCE) y la psoriasis, y con sujetos sanos como control. Además, se caracterizaron y compararon los niveles de expresión de los receptores objetivo-correspondientes PAR-2 y 4, receptores de histamina H1 y H4 (H1R, H4R), así como de las células cebadas en la piel de los pacientes y sujetos sanos de control.
MÉTODOS
Sujetos del estudio
Se reclutaron pacientes con diagnóstico confirmado por dermatólogos de dermatitis atópica (DA), psoriasis, urticaria crónica espontánea (UCE) y sujetos sanos como controles (CS) (20 voluntarios en cada grupo) (Tabla 1). El comité de ética local y la oficina de protección de datos de La Caridad—Universidad de Medicina de Berlín aprobaron el estudio (EA2/036/17) y todos los participantes proporcionaron su consentimiento informado. Sólo se reclutaron pacientes sin prurito crónico asociado a otras enfermedades subyacentes y voluntarios sanos sin enfermedades cutáneas ni prurito. Se incluyeron pacientes con DA y psoriasis sólo si presentaban lesiones activas junto con áreas libres de lesiones en sus antebrazos volares. No se permitió a los sujetos del estudio tomar inmunosupresores sistémicos 4 semanas, antihistamínicos 5 días, ni corticoesteroides tópicos o inhibidores de la calcineurina 2 semanas antes de la visita al estudio.
Provocación cutánea
Se realizaron provocaciones cutáneas tanto en la piel lesionada (DA y psoriasis) como en la piel no lesionada (todos los sujetos) en los antebrazos volares, al inicio con Mucuna pruriens, al frotar de manera suave 40-45 espículas durante 45 segundos en un área de 4 cm² y seguido (después de que el prurito se disipara) por una prueba cutánea por punción (PCP) con histamina y su vehículo como control negativo (10 mg/mL de diclorhidrato de histamina, ALK-Abello, Horsholm, Dinamarca). La aplicación (izquierda vs. derecha) de la provocación con Mucuna pruriens y con histamina se realizó de manera aleatoria. Todos los experimentos se realizaron por el mismo examinador bajo temperatura constante (20-24°C) y humedad del aire constante (40-60 %).
Evaluación de la intensidad percibida del prurito y sensaciones
La intensidad del prurito se incluyó de manera autoevaluada por los sujetos cada minuto después de la provocación, con la escala visual análoga (EVA, con un rango de 0 “sin prurito” a 100 mm “el peor prurito imaginable”) hasta que el prurito se disipara. Se analizaron la duración del prurito (valores por encima de una puntuación EVA >3 mm), la intensidad máxima del prurito y la intensidad total del prurito a lo largo del tiempo, expresada como área bajo la curva (AUC), y se realizaron comparaciones entre pacientes y sujetos sanos control, así como entre piel lesionada y no lesionada.
Evaluación de la reacción de eritema inducida por histamina
El tamaño del eritema se midió 5 minutos después de la PCP. Se midieron con una regla el diámetro mayor (x) y el diámetro rectangular (y) para calcular el área de superficie (x/2 * y/2 * π). El eritema sólo se evaluó en la piel no lesionada, ya que en la piel lesionada el eritema preexistente impidió su evaluación precisa.
El área de aumento del flujo sanguíneo superficial se midió con imágenes de contraste de moteado láser (LSCI; FLPI-2, Moor Instruments, UK) antes y 5 minutos después de la provocación con histamina. El área de aumento del flujo sanguíneo se calculó después de la sustracción del umbral promedio individual de flujo sanguíneo antes del área de provocación más 2 DE, como se describió de manera previa.
Inmunohistoquímica y cuantificación
Se obtuvieron biopsias por punción (4 mm) de la piel lesionada y no lesionada del antebrazo volar en 10 pacientes con DA y 10 con psoriasis, y de la piel no lesionada del antebrazo volar en 11 pacientes con UCE y 12 sujetos sanos control. Todas las biopsias se fijaron en paraformaldehído-lisina-periodato (PLP) y embebieron en parafina. La inmunohistoquímica se realizó con anticuerpos para triptasa (M7052, clon AA1, Dako Denmark, Glostrup, Dinamarca), PAR-2 (sc-13504, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, USA), PAR-4 (ab5787, abcam, Cambridge, UK), Receptor de Histamina H1 (LS-B1745-50, LS Bio, Seattle, Washington, USA) y Receptor de Histamina H4 (NLS3775, Novus Biologicals, Littleton, Colorado, USA). El número de células cebadas (CC) en la capa dérmica superior se contó de manera manual y de forma ciega en el área total de 5 campos adyacentes de 0.099 mm² cada uno (0.315 mm de profundidad y 1.573 mm de ancho) a un aumento de 40x. Los parámetros de hiperqueratosis (grosor epidérmico que incluía el estrato córneo, grosor epidérmico suprapapilar y longitud de las crestas interpapilares) se evaluaron con el uso del programa ImageJ 1.48v (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, USA).
El análisis ciego de la expresión de PAR-2, PAR-4, H1R y H4R se realizó por un patólogo (M.W.D) quien evaluó la extensión de la tinción (rango de puntuación 1-4, es decir, el porcentaje de células teñidas de forma positiva; <25 % = 1, 25 %-50 % = 2, 51 %-75 % = 3, >75 % = 4) en queratinocitos, células perivasculares y endoteliales. Las imágenes se analizaron con el uso del programa de visualización de imágenes OlyVIA 2.4 (Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japón).
Análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con IBM SPSS Statistics, versión 25.0 (IBM Corp., Armonk, N.Y., EE. UU.), y los gráficos se crearon con GraphPad Prism versión 9.1.0 (GraphPad Programa, San Diego, California, EE. UU.). Las diferencias entre grupos independientes se evaluaron con la prueba t de Student para variables paramétricas y con la prueba U de Mann-Whitney para variables no paramétricas. Para variables paramétricas dependientes (piel lesionada vs. no lesionada), con la prueba t pareada. Para evaluar correlaciones entre los parámetros de prurito y la gravedad de la enfermedad, con el coeficiente de correlación de Pearson. La significancia estadística se estableció en p < 0.05.
RESULTADOS
La piel de los pacientes con dermatitis atópica, pero no con psoriasis o UCE, está sensibilizada para el prurito inducido por Mucuna pruriens
La provocación con Mucuna pruriens en la piel no lesionada de pacientes con DA indujo una respuesta de prurito que se prolongó un 74 % en comparación con la provocación en controles sanos (CS) (15.8±8.5 vs. 9.1±8.9 minutos, p = 0.020) (Figura 1a,b). En contraste, los pacientes con psoriasis o UCE no mostraron diferencias con respecto a los CS en ninguno de los parámetros de prurito evaluados, tanto para la provocación con Mucuna pruriens como con histamina (Figura 1b–g).
En los pacientes con DA, la piel lesionada estaba aún más sensibilizada para el prurito que la piel no lesionada, es decir, la intensidad y la duración del prurito estaba aún más aumentado. En la psoriasis, no se observaron diferencias entre la piel lesionada y la no lesionada (Figura 1a–g). La duración del prurito inducido por Mucuna pruriens en pacientes con DA se encontró casi 1.5 veces mayor después de la provocación en piel lesionada que en piel no lesionada (22.8 ± 10.7 vs. 15.8 ± 8.5 minutos, p = 0.012) y 2.5 veces mayor que en CS (22.8 ± 10.7 vs. 9.1 ± 8.9 minutos, p <0.001) (Figura 1a,b,e). Las intensidades máximas y totales (área bajo la curva, AUC) del prurito inducido por Mucuna pruriens en pacientes con DA se encontraron mayores después de la provocación en piel lesionada en comparación con los CS (p = 0.049 y p = 0.004, de manera respectiva) (Figura 1c,d). En comparación con los CS, la histamina sólo resultó en un aumento en la duración del prurito y en las intensidades máxima y total del prurito después de la provocación en la piel lesionada de pacientes con DA (p = 0.009, p = 0.002 y p = 0.001, de manera respectiva) pero no después de la provocación en la piel no lesionada (p = 0.703, p = 0.289 y p = 0.236, de manera respectiva) (Figura 1e–g).
En pacientes con dermatitis atópica y psoriasis, la reacción de eritema neurogénico está desregulada
El eritema inducido por histamina se midió mediante morfometría cuantitativa en la piel no lesionada. Comparado con el grupo de control sano (CS), la respuesta de eritema se redujo tanto en pacientes con dermatitis atópica (DA) (p <0.001) como en aquellos con psoriasis (p = 0.001), pero no en pacientes con urticaria crónica espontánea (UCE) (Figura 2a). Además, el área de aumento del flujo sanguíneo tras la provocación con histamina, evaluada mediante imágenes de contraste de motas láser, se mostró casi dos veces más pequeña en la piel no lesionada de pacientes con DA (340.9 ± 266.6 mm²), en la piel lesionada de DA (314.6 ± 308.2 mm²) y en la piel no lesionada de psoriasis (351.9 ± 296.8 mm²), y más de tres veces más pequeña en la piel lesionada de psoriasis (169.2 ± 192.6 mm²), en comparación con los CS (608 ± 361.3 mm², p = 0.018, p = 0.006, p = 0.013 y p <0.001, de manera respectiva) (Figura 2a, b).
Los receptores activados por proteasas y de histamina están sobreexpresados en la piel no lesionada de pacientes con dermatitis atópica
En comparación con los CS, la piel no lesionada de pacientes con DA mostró una mayor expresión de PAR-2 y PAR-4, así como de los receptores H1R y H4R en las regiones perivasculares de la dermis superior (Figura 3; Tabla 2) y de H4R y PAR-4 en células endoteliales y queratinocitos, de manera respectiva (Figura 3; Tabla 2). En comparación con la piel no lesionada de pacientes con psoriasis y UCE, la expresión de PAR-4 en queratinocitos y de H4R perivascular también se encontró mayor en la piel no lesionada de DA (Tabla 2). La tinción para triptasa mostró casi el doble del número promedio de células cebadas en la piel no lesionada de pacientes con DA en comparación con los CS. Sin embargo, esta diferencia no alcanzó significancia estadística (90.3 ± 57.5 vs. 53.6 ± 27.8, p = 0.088) (Tabla 2).
En pacientes con psoriasis, la piel no lesionada mostró una mayor expresión de PAR-4 perivascular, y los pacientes con UCE exhibieron una mayor expresión de PAR-2, PAR-4 y H1R en comparación con los CS. En la piel lesionada de pacientes con DA y psoriasis, la expresión de los PAR perivasculares y de los receptores de histamina en las células endoteliales se incrementó de manera similar a la piel no lesionada de DA (Tabla 2). Además, los queratinocitos sobreexpresaron H4R en las lesiones cutáneas de ambos grupos de pacientes, y PAR-2 sólo en las lesiones cutáneas de pacientes con DA (Tabla 2). El número promedio de células cebadas se encontró más del doble en las lesiones cutáneas de pacientes con DA y psoriasis en comparación con los CS (p = 0.006 para ambos) (Tabla 2). Sólo en la piel lesionada de pacientes con DA, el mayor número de células cebadas se asoció con una menor intensidad general del prurito inducido por Mucuna pruriens (R = − 0.814, p = 0.004). La actividad clínica respectiva de la enfermedad (evaluada mediante SCORAD, EASI local, PASI, PASI local, UAS7) no se correlacionó con la intensidad del prurito inducido, la reacción de eritema cutáneo ni con la expresión de los receptores en la piel (Tabla 3). En la piel no lesionada de DA, todos los parámetros epidérmicos analizados mostraron un engrosamiento de la epidermis, similar a la piel lesionada de DA y psoriasis, pero en menor medida (Tabla 4).
DISCUSIÓN
Los resultados de este estudio muestran que la piel no lesionada de los pacientes con dermatitis atópica está sensibilizada al prurito inducido por Mucuna pruriens y exhibe una respuesta de enrojecimiento neurogénico alterada y una sobreexpresión de receptores activados por proteasas y de histamina en comparación con la piel sana. Este hallazgo enfatiza que en los pacientes con dermatitis atópica, la ausencia de piel inflamada no implica piel sana.
De manera previa, se demostró que el prurito inducido por Mucuna pruriens se prolonga en la piel no lesionada de pacientes con dermatitis atópica en comparación con controles sanos, lo cual lo confirmaron Andersen et al. En este estudio, se evaluó, hasta donde se sabe por primera vez, el prurito inducido por Mucuna pruriens en diferentes dermatosis inflamatorias crónicas y en sujetos control sanos. Se extendieron los hallazgos previos que revelaron que el prurito inducido por Mucuna pruriens se prolonga sólo en dermatitis atópica, y no en urticaria crónica espontánea ni en psoriasis. Este hallazgo subraya la dominancia de la vía del prurito no histaminérgico, dependiente de Mucuna pruriens, en la dermatitis atópica, lo que explica la respuesta limitada a los antihistamínicos en esta condición. Además, se identificó una expresión aumentada de PARs en la dermis y epidermis de la piel no lesionada de pacientes con dermatitis atópica, lo que podría explicar su presensibilización hacia el agonista de PAR, mucunaína, contenido en la Mucuna pruriens. También se observó un aumento en el número de células cebadas en la piel de los pacientes con dermatitis atópica, en línea con informes previos. Esto puede explicar la mayor sensibilidad de la piel con dermatitis atópica a las proteasas por dos razones. Primero, las células cebadas pueden liberar triptasa, un agonista conocido de PAR, un mecanismo que de manera previa se sugirió como relevante en la dermatitis atópica. Segundo, las proteasas pueden activar miembros de la familia MRGPR en las células cebadas, lo que puede contribuir a la alergia y a la sensación de prurito.
De manera reciente, se reportó un aumento en la actividad de serina proteasas en la piel lesionada y no lesionada de pacientes con dermatitis atópica. El aumento en la expresión de PARs, junto con la expresión aumentada de sus agonistas y células efectoras en la piel no lesionada, puede contribuir de forma significativa al prurito independiente de histamina en la dermatitis atópica, y podría preceder y promover la inflamación y la sensibilización alérgica. La dermatitis atópica a menudo se exacerba después de la exposición a ácaros del polvo y alérgenos de cucarachas, que exhiben actividades de proteasas y activan a PAR-2, lo que conduce a un retraso en la recuperación de la barrera epidérmica tras la disrupción de la barrera, lo que podría promover la sensibilización alérgica por medio de la barrera cutánea dañada. La exposición crónica a la proteasa cisteína exógena Ficina contenida en las plantas de higo puede promover la sensibilización a los aeroalérgenos del higo. El contacto prolongado de la piel presensibilizada con dermatitis atópica con proteasas de cisteína puede llevar a la liberación de alarminas y, en consecuencia, promover la respuesta Th2 y la sensibilización. La sensibilización de las fibras C polimodales mecanosensibles activadas por Mucuna pruriens en la piel no lesionada de la dermatitis atópica también podría explicar el fenómeno de intolerancia a la lana, que es uno de los criterios menores de la dermatitis atópica. Estos hallazgos abogan por la investigación y el desarrollo de intervenciones terapéuticas dirigidas a disminuir la interacción entre proteasas y PARs, como el uso tópico propuesto de manera previa de inhibidores de proteasas en la dermatitis atópica. En consonancia con esto, un estudio reciente investigó el efecto de una pepducina que penetra en las células y bloquea la vía PAR-2 en un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer y encontró una marcada reducción del picor y una atenuación de la inflamación de la piel.
A diferencia de la Mucuna pruriens, la piel no lesionada de los pacientes con dermatitis atópica no estaba sensibilizada para la histamina. El prurito inducido por histamina se incrementó sólo en la piel lesionada por dermatitis atópica, lo que está en línea con varios informes previos y puede explicarse tanto por una sensibilización periférica que conduce a una mayor respuesta de las fibras C mecanosensibles a la histamina, como por una sensibilización central de las neuronas procesadoras de prurito en la dermatitis atópica. Sólo un estudio mostró que no había diferencias en el prurito inducido por histamina en la piel lesionada de la dermatitis atópica y otro incluso mostró una reducción del prurito en la piel lesionada por dermatitis atópica. Sin embargo, en estos experimentos, los pacientes dejaron de tomar antihistamínicos de manera inmediata antes de participar en el estudio, lo que pudo atenuar la percepción del prurito inducido por histamina. Estudios previos tampoco encontraron diferencias en el prurito inducido por histamina en pacientes con psoriasis y urticaria crónica espontánea en comparación con controles sanos, o encontraron un prurito inducido por histamina aún más débil en pacientes con psoriasis en comparación con controles sanos.
En línea con estudios previos, la inflamación neurogénica inducida por histamina, reflejada por el tamaño del enrojecimiento y el área de aumento del flujo sanguíneo, se encontró menor en pacientes con dermatitis atópica y psoriasis. En la dermatitis atópica, se observó una reducción de manera previa al enrojecimiento en respuesta a la acetilcolina y a neuropéptidos como la sustancia P y el VIP, IL-2 e IL-31. La razón para esta reacción vascular neurogénica anormal aún se desconoce. Las posibles explicaciones incluyen tolerancia o taquifilaxia de las estructuras diana, aumento del tono vasoconstrictor, disminución de la activación de pruriceptores periféricos y liberación reducida de neuropéptidos o disminución de la expresión de receptores en las estructuras diana. Existen otras respuestas vasculares atípicas en la dermatitis atópica, como el dermografismo blanco debido a una vasoconstricción anormal, que también se considera uno de los criterios diagnósticos menores de la dermatitis atópica. De forma obvia, existe una notable discordancia entre una disminución de la reacción de enrojecimiento y el aumento en las puntuaciones de prurito tras la provocación con histamina, de manera notable sólo en la piel lesionada de la dermatitis atópica, lo cual también se observó en un estudio previo.
Dado que la Mucuna pruriens activa PAR-2 y 4, se buscó su expresión en la piel. Los PARs desempeñan un papel funcional en la inflamación cutánea y el prurito en la dermatitis atópica y se expresan por varios tipos de células, como queratinocitos, células cebadas y fibras nerviosas sensoriales. Los análisis inmunohistológicos mostraron que la expresión de PAR-2 y 4 se eleva tanto en la piel lesionada como en la no lesionada de pacientes con dermatitis atópica, así como en lesiones cutáneas de pacientes con psoriasis. Con la excepción de un estudio de Steinhoff et al., los estudios previos examinaron sólo piel lesionada y encontraron una expresión elevada de PAR-2 en pacientes con dermatitis atópica. Dado que los PARs y sus agonistas están involucrados en el prurito y la inflamación neurogénica en la dermatitis atópica, deben desarrollarse terapias específicas que apunten a este mecanismo para aliviar el prurito y prevenir la exacerbación y el empeoramiento de la dermatitis atópica. La piel no lesionada de la dermatitis atópica expresa de manera alta H1R y H4R, que están involucrados en la transmisión del prurito histaminérgico. Esto también se observó en lesiones cutáneas de la dermatitis atópica y la psoriasis, pero no en áreas sin lesiones de la piel con psoriasis. Resultados previos también reportaron una mayor expresión de H4R en lesiones psoriáticas y en varias células de la piel con dermatitis atópica. Sin embargo, hay datos escasos sobre el nivel de expresión de los receptores de histamina en la piel no lesionada de la dermatitis atópica. Por lo tanto, la mayor expresión de H4R puede explicar la sensibilización aumentada al prurito mediado por histamina en la dermatitis atópica, pero no en la psoriasis.
Cabe mencionar que no se evaluaron de manera directa los receptores en las fibras nerviosas. Sin embargo, el aumento en la expresión global de PARs y HRs en la piel puede acompañarse por su sobreexpresión en las fibras nerviosas. O bien, puede llevar a una mayor reactividad de la piel a sus agonistas y a la liberación de mediadores secundarios que aumentan el prurito y la inflamación.
Se observó que el número de células cebadas en la dermis superior de la piel lesionada en la dermatitis atópica y la psoriasis, y en la piel no lesionada de la dermatitis atópica, era el doble que en los controles sanos (aunque esto último no alcanzó significancia estadística). Esto está en línea con múltiples resultados previos para las lesiones psoriáticas y la piel lesionada y no lesionada de la dermatitis atópica. En este estudio, la diferencia en el número de células cebadas en la dermis superior en la urticaria crónica espontánea no alcanzó significancia estadística en comparación con los controles sanos. Los estudios previos fueron contradictorios. Algunos autores describen un número mayor de células cebadas, mientras que otros reportaron que no hay diferencias entre pacientes con urticaria crónica espontánea y controles sanos.
La piel no lesionada de los pacientes con dermatitis atópica, a diferencia de las áreas sin lesiones de los pacientes con urticaria crónica espontánea y psoriasis, mostró características epidérmicas alteradas similares a la piel lesionada, con parámetros generales más grandes de grosor epidérmico. La morfología de la barrera cutánea alterada en la piel no lesionada, sana de forma aparente, de los pacientes con dermatitis atópica de manera posible contribuye a la sensibilización al prurito, junto con anormalidades en su función inmune y de barrera, y la diferenciación terminal de los queratinocitos. De acuerdo con estudios previos, no se encontró correlación entre la gravedad de la enfermedad y la intensidad del prurito inducido. Además, el estado clínico de la enfermedad no correlacionó con la densidad de receptores epidérmicos.
En conclusión, se mostró por primera vez que la piel no lesionada de los pacientes con dermatitis atópica difiere de manera clara de la piel sana al exhibir una duración prolongada del prurito inducido por Mucuna pruriens, un aumento de células cebadas y una sobreexpresión de receptores activados por histamina y proteasas, lo cual no se encontró en otras enfermedades cutáneas inflamatorias crónicas. Estos hallazgos resaltan la importancia de la vía del prurito no histaminérgico mecanosensible en la dermatitis atópica y apoyan aún más el valor potencial de la intervención terapéutica temprana y proactiva para tratar de manera adecuada el prurito en la dermatitis atópica, incluso si las lesiones aún no son visibles.
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Med. Rosa Ivett Guzmán Avilán Profesor
Dr. Evaristo Noe Lemus Reyner Residente de 1er año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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