Las interacciones inmunitarias entre el sistema nervioso central (SNC) y los sistemas de órganos periféricos se regulan de forma estrecha. El estrés psicosocial puede afectar de manera profunda esta comunicación bidireccional, y las interacciones neuroinmunitarias interrumpidas se reconocen cada vez más como factores importantes en la patogénesis de los trastornos relacionados con el estrés. El estrés crónico activa el sistema inmunitario innato, lo que resulta en la movilización de células mieloides periféricas (por ejemplo, monocitos y neutrófilos) y la producción de citocinas proinflamatorias, como la interleucina-6 (IL-6).
En humanos, está bien establecido que un subconjunto de pacientes con trastornos neuropsiquiátricos relacionados con el estrés, como el TDM, exhiben un estado de inflamación crónica de grado bajo, caracterizado por un aumento de citocinas proinflamatorias circulantes y leucocitosis. Además de estos cambios inmunitarios periféricos, el estrés interrumpe la barrera hematoencefálica (BHE) endotelial en ratones, y permite una mayor entrada de proteínas circulantes de forma directa en regiones de recompensa del cerebro, como el núcleo accumbens (NAc). Aunque estos hallazgos proporcionan importantes conocimientos sobre la fisiopatología del estrés y la depresión, todavía se sabe poco acerca de los mecanismos por los cuales estos cambios inmunitarios inducidos por el estrés afectan la función neuronal y, en última instancia, el comportamiento.El estrés crónico afecta a los monocitos
Para investigar los efectos del estrés psicosocial en el sistema inmunológico y cómo afecta al cerebro, se utilizó el paradigma de estrés crónico por derrota social (ECDS). Los conflictos interpersonales y el acoso social son estresores psicológicos experimentados de forma común que pueden precipitar un episodio depresivo mayor. El paradigma ECDS—uno de los ejemplares múridos de estrés psicosocial mejor validados—consiste en que los ratones experimentales se subordinan por un ratón CD-1 agresivo por medio de una combinación de contacto físico y exposición sensorial durante diez días. La mayoría de los ratones estresados desarrollan un fenotipo conductual caracterizado por la evitación social y una reducción en la preferencia por recompensas naturales (anhedonia), como una recompensa social deteriorada. También desarrollan varias alteraciones fisiológicas, como síndrome metabólico, inflamación sistémica y trastornos gastrointestinales. Estos ratones se denominan ratones susceptibles al estrés (SUS). Sin embargo, un subconjunto de ratones muestra perfiles conductuales y fisiológicos similares a los ratones de control no estresados (CON)—estos se denominan ratones resilientes (RES).
Primero se realizó una fenotipificación de alta dimensión de células inmunitarias de ratones CON, SUS y RES a partir de la circulación y el cerebro con citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) (Fig. 1a y Fig. 1a de Datos Extendidos). De acuerdo con estudios previos, se compiló un panel de anticuerpos de receptores de superficie para capturar los principales linajes de células inmunitarias (Tabla Suplementaria 1). En la sangre, el ECDS condujo a un aumento en monocitos inflamatorios Ly6Calto y neutrófilos, y una disminución en células B en ratones SUS y RES (Fig. 1b,y Fig. 1b–de Datos Extendidos; la información estadística detallada para cada experimento se proporciona en la Tabla Suplementaria 2).
Para investigar si estos hallazgos preclínicos en ratones también se traducen a trastornos de estrés en humanos, se evaluaron las subpoblaciones de leucocitos en sangre de pacientes con TDM y controles sanos, y se encontró que los pacientes con TDM mostraron leucocitosis impulsada por un aumento en el número de monocitos y neutrófilos, pero sin diferencias en linfocitos, como células B totales, células B no expuestas, células B transicionales y células B de memoria (Fig. 1d,f, Fig. 2a–j de Datos Extendidos y Tabla Suplementaria 3). También se observó una correlación positiva significativa entre el número de monocitos y neutrófilos en circulación con el estrés percibido con la Escala de Estrés Percibido, una medida autoinformada de estrés validada de manera clínica (Fig. 1e,g).
Se evaluaron los leucocitos en cerebros completos sin meninges de ratones tras ECDS y se observó un aumento específico de monocitos proinflamatorios Ly6Calto en ratones SUS, pero no en ratones RES, en comparación con los ratones CON (Fig. 1h,i y Fig. 1f–h de Datos Extendidos). Para prevenir la contaminación con leucocitos circulantes, los cerebros se perfundieron por completo con PBS. De forma notable, no se observaron diferencias en otros leucocitos o células residentes en el cerebro, como la microglía o los macrófagos asociados a los bordes (Fig. 1i de Datos Extendidos). Al final, se evaluaron las subpoblaciones de leucocitos (monocitos, neutrófilos, células B y células T) en leptomeninges, duramadre y plexo coroideo después de ECDS mediante citometría de flujo. En las leptomeninges, se observó un aumento de forma única en los monocitos de los ratones SUS, mientras que en la duramadre hubo un aumento tanto en ratones SUS como RES, en comparación con los ratones CON. No se observaron cambios en las frecuencias de monocitos en el plexo coroideo (Fig. 1j–l de Datos Extendidos).
Para investigar las diferencias en los cambios transcripcionales inducidos por el estrés en las principales subpoblaciones de leucocitos circulantes de ratones CON, SUS y RES, se realizó secuenciación de ARN específica del tipo celular de monocitos Ly6Calto y Ly6Cbajo, células B y células T (Fig. 1j y Fig. 3a–d de Datos Extendidos). Los cambios inducidos por el ECDS en la expresión génica se mostraron más pronunciados en los monocitos Ly6Calto, con un total de 785 genes expresados de forma diferencial en ratones SUS versus CON y 311 genes expresados de forma diferencial en ratones RES versus CON (valor de P ajustado < 0.05 y cambio campo log2 >|1|) (Fig. 1k,l y Fig. 3e de Datos Extendidos), de modo aproximado 10 veces menos genes expresados de forma diferencial en los otros tipos celulares (Fig. 3f–q de Datos Extendidos). Luego se realizó un análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) de procesos biológicos, componentes celulares y función molecular. Los genes con aumento de expresión en ratones SUS versus CON se involucraron en procesos biológicos de GO como la respuesta inmune innata (GO:0045087) y la respuesta inflamatoria (GO:0006954) y componentes celulares como el ECS (GO:0005615) (Fig. 1m). En conjunto, el ECDS aumentó el número de monocitos en circulación y en el cerebro e indujo una firma transcripcional proinflamatoria en ratones SUS. Estos hallazgos, que enfatizan el papel de las células mieloides periféricas en trastornos vinculados al estrés como el TDM, están en línea con varios estudios preclínicos y estudios en humanos. Por lo tanto, los autores se centraron en esclarecer los mecanismos por los cuales los monocitos periféricos pueden afectar la función neuronal y el comportamiento.
Los monocitos que migran al cerebro expresan Mmp8
Primero, se buscó investigar las ubicaciones exactas donde los monocitos inflamatorios Ly6Calto migran en el cerebro (en adelante referidos como monocitos que trafican al cerebro). Se realizó un mapeo anatómico detallado de los monocitos con el método de aclaramiento de tejidos de cerebro completo iDISCO+. Con la línea de reporteros Ccr2rfp, en la cual los monocitos expresan una proteína fluorescente roja, se aclararon los cerebros de ratones CON, SUS y RES, luego se realizó microscopía de láminas de luz y se registraron las muestras en el Atlas Cerebral de Allen con ClearMap. Primero se analizó el total de células en cerebros completos y se confirmaron los datos de Citometría de Masas que mostraron un aumento de monocitos sólo en ratones SUS y una correlación negativa con la proporción de interacción social (IS) (Fig. 2c y Fig. 4f de Datos Extendidos). Luego, se examinó la correlación entre los monocitos en regiones específicas del cerebro y el comportamiento de evitación social. El recuento de células en áreas límbicas del cerebro como el NAc se correlacionó de manera alta con la proporción de IS, donde un número mayor de monocitos en el NAc se correlacionó con un mayor comportamiento de evitación social (Fig. 2d, Fig. 4g,h de Datos Extendidos y Tabla Suplementaria 4). El NAc es una región cerebral sensible al estrés que es central para el procesamiento de estímulos gratificantes y aversivos, y es fundamental en la mediación de la sintomatología depresiva. En contraste con el NAc, no se observó un aumento en el tráfico de monocitos dirigido a la corteza prefrontal (CPF) ni una correlación significativa entre la proporción de IS y los monocitos en la CPF. La microscopía confocal reveló que los monocitos se adhirieron a la vasculatura en el NAc pero no se infiltraron en el parénquima cerebral o el espacio perivascular.
A continuación, se investigó cómo los monocitos que trafican al cerebro contribuyen a la evitación social inducida por el estrés y se realizó secuenciación de ARN de una sola célula de monocitos que trafican al cerebro después de ECDS. La agrupación no supervisada de monocitos Ccr2rfp+ reveló cuatro grupos únicos basados en sus perfiles transcripcionales. El Grupo 0 estaba enriquecido en ratones SUS en comparación con ratones CON y RES. Para determinar los genes que definen cada grupo, se realizó un análisis de expresión génica diferencial para investigar los genes expresados de forma diferencial entre los grupos y el total de genes. Se encontró que varios genes conocidos por estar involucrados en procesos inflamatorios aumentaban su expresión en el Grupo 0. El análisis de términos de GO de los genes que aumentaban su expresión del Grupo 0 reveló su participación en procesos de oxidación-reducción, en el espacio extracelular y en la matriz extracelular. Uno de los principales genes enriquecidos en estas vías fue el Mmp8, que codifica la metaloproteinasa de matriz 8. Es importante destacar que Mmp8 también es uno de los genes expresados de forma diferencial más importantes en monocitos Ly6Calto circulantes de ratones SUS en comparación con ratones CON, al igual que el término de GO en el espacio extracelular. No se observó un aumento en la expresión génica de Mmp8 en monocitos de leptomeninges, duramadre o plexo coroideo en ratones SUS, lo que indica que la fuente de MMP8 en el cerebro es probable que sea de monocitos circulantes. También se realizó secuenciación de ARN de una sola célula de células inmunitarias residentes en el NAc, sin embargo, no se observaron cambios inducidos por el estrés en las firmas génicas homeostáticas o inflamatorias. Los resultados son consistentes con estudios recientes realizados en muestras de cerebro post-mortem de personas con TDM, donde no se encontró evidencia de firmas proinflamatorias en la microglía.
MMP8 pertenece al grupo de las colagenasas que deriva y se secreta de manera principal por los neutrófilos y monocitos. Los datos y estudios previos sugieren que, a diferencia de muchas otras MMP, MMP8 no se produce ni secreta por ninguna célula del sistema nervioso central, incluidas las células mieloides residentes en el cerebro. Es importante destacar que, en un estudio de expresión génica en sangre total, MMP8 estuvo entre los genes más sobreexpresados en pacientes con TDM en comparación con controles sanos. Además, un polimorfismo de un solo nucleótido en la región codificante de Mmp8 se asoció con TDM. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que vinculan MMP8 con TDM no se exploraron. MMP8 activado puede dividir una amplia gama de componentes de la matriz extracelular, como colágenos, fibronectinas, tenascinas y agrecanos, muchos de los cuales son componentes de la matriz extracelular cerebral.
MMP8 se correlaciona con cambios en el espacio extracelular cerebral
Para probar si la MMP8 derivada de mieloides circulantes puede promover la susceptibilidad al estrés, primero se confirmó el aumento inducido por el estrés en MMP8 a nivel de proteína en plasma después de ECDS, y se mostró que los niveles de MMP8 se correlacionaron de manera negativa con la proporción de interacción social. Además, se demostró que tanto 10 días de ECDS como 21 días de estrés crónico variable aumentaron los niveles de MMP8 en plasma en ratones hembra. Se midieron también los niveles de otras proteínas MMP como MMP2, MMP3, proMMP9 y MMP12 en los mismos ratones mostrados en la Figura 3a después de 10 días de ECDS. Al final, se validó el aumento de MMP8 en suero de pacientes con TDM en comparación con controles sanos y se encontró una correlación positiva con el estrés percibido autoinformado. Se confirmó además que MMP8 se incrementó en el NAc pero no en la CPF de ratones SUS después de ECDS. Al inyectar de forma retroorbitaria MMP8 recombinante de ratón biotinilado en ratones susceptibles al estrés, se demostró que MMP8 periférica puede acceder al parénquima cerebral. Cómo MMP8 accede al parénquima cerebral es una pregunta importante. El laboratorio demostró de manera reciente que el ECDS conduce a una reducción de la expresión de la proteína de unión estrecha endotelial claudina 5 (CLDN5) y un aumento de la permeabilidad de la BHE en ratones SUS en comparación con ratones RES y CON. Por lo tanto, se planteó la hipótesis que MMP8 puede acceder al cerebro a través de una BHE dañada. Para demostrar esto, de manera experimental se interrumpió la BHE mediante la disminución de Cldn5 en el NAc mediante la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado que expresa un ARN de pelo corto (shRNA) dirigido a Cldn5 o un transcripto no dirigido al blanco. Después de una derrota social subumbral, se inyectó rMMP8 biotinilada de forma retroorbitaria en circulación, se perfundió de manera minuciosa el cerebro del ratón con PBS para eliminar la rMMP8 circulante y se realizó tinción inmunohistoquímica y cuantificación de rMMP8. Se encontró que la disminución de Cldn5 aumentó los niveles de rMMP8 biotinilada en el parénquima cerebral en comparación con ratones inyectados con el vector no dirigido al blanco.
Luego se investigó si el ECDS afecta el espacio extracelular (ECS) del cerebro. Primero, se evaluó el porcentaje de ECS con imágenes de microscopía electrónica de transmisión de secciones de tejido del NAc y la CPF de ratones después de ECDS. En comparación con los controles no estresados, los ratones SUS mostraron fracciones aumentadas de volumen de ECS en el NAc, mientras que no se observaron diferencias entre los grupos en la CPF. Los aumentos en el volumen del ECS cerebral se describieron en otras patologías del sistema nervioso central, como los trastornos neurodegenerativos, y pueden ser el resultado de conexiones celulares interrumpidas asociadas con la degradación de la matriz extracelular. Es importante destacar que las fracciones de volumen del ECS en el NAc, pero no en la CPF, se correlacionaron de manera positiva con la MMP8 periférica en los mismos ratones. MMP8 se demostró que degrada de forma proteolítica el agrecano—una proteína importante del ECS, que se une a otras glicoproteínas y proteoglicanos como el ácido hialurónico en la superficie celular de las neuronas y las células gliales, y es por consiguiente crucial en la organización del ECS neuronal. Estudios de dolor crónico en un modelo de ratón revelaron que, en el hipocampo, el aumento de MMP8 se asoció con una disminución del agrecano y cambios estructurales en la matriz extracelular. Por lo tanto, se cuantificó la cantidad de agrecano en el NAc de ratones CON, SUS y RES y se encontró una disminución de la expresión en ratones SUS en comparación con ratones CON, una correlación positiva entre los niveles de agrecano y la proporción de interacción social, y una correlación negativa entre la MMP8 periférica y el agrecano. Al final, para probar si alterar de manera directa el ECS afecta el comportamiento social, se implantaron cánulas bilaterales en el NAc y, para imitar la naturaleza crónica del ECDS, se infundió hialuronidasa (una enzima que degrada el ácido hialurónico) o vehículo una vez al día durante diez días. Se encontró un aumento en el comportamiento de evitación social en ratones tratados con hialuronidasa en comparación con ratones inyectados con vehículo, lo que respalda aún más los datos que sugieren que los cambios en el ECS del NAc se relacionan con cambios en el comportamiento social.
MMP8 regula la evitación social
Luego, se determinó si MMP8 se vincula de manera causal a la evitación social inducida por el estrés. Primero, se probó si la combinación de una inyección intraperitoneal de rMMP8 (a una dosis que produce niveles plasmáticos similares de MMP8 a los que se observaron en ratones SUS después de ECDS) junto con una derrota social subumbral promueve la susceptibilidad al estrés. Se encontró que la combinación de rMMP8 y estrés subumbral condujo a una proporción Sl más baja en comparación con ratones no estresados. Luego, se probo si rMMP8 también cambiaba la preferencia social al probar ratones con un ratón juvenil del mismo sexo y no amenazante mediante una prueba de preferencia de lugar condicionado social (sCPP). Este paradigma se usó de manera histórica para evaluar la recompensa social. Mientras que los ratones que recibieron inyecciones de vehículo durante tres días de un ECDS subumbral formaron una preferencia por la cámara que se asoció de manera previa con el ratón juvenil, la preferencia social se atenuó en los ratones que recibieron rMMP8.
Para eliminar de forma selectiva Mmp8 en los leucocitos periféricos y prevenir efectos no específicos de la eliminación germinal de Mmp8, se crearon ratones quiméricos que carecen de Mmp8 de manera específica en los leucocitos periféricos (Mmp8−/− → WT) o controles de tipo salvaje (WT → WT) mediante trasplante de médula ósea (TMO) con células madre hematopoyéticas de donantes de ratones Mmp8−/− o Mmp8+/+ (tipo salvaje). Estos ratones quiméricos se expusieron a ECDS y se sometieron a pruebas de comportamiento y evaluación del ECS en el NAc y la CPF. Primero se validó la eficacia del experimento del TMO y se encontró una disminución completa de MMP8 en la sangre de los ratones Mmp8−/− → WT, lo que validó la eficiencia del TMO y confirmó que la fuente de MMP8 es de hecho de los leucocitos periféricos. También se encontró un alto quimerismo (85-90 %) y no hubo diferencias en las frecuencias de monocitos periféricos, neutrófilos, citocinas o quimiocinas entre los ratones de tipo salvaje y los ratones carentes de TMO, lo que sugiere que la disminución periférica de MMP8 no conduce a cambios importantes en el sistema inmunológico periférico. En cuanto al comportamiento de los ratones que se trasplantaron con células madre hematopoyéticas de ratones Mmp8−/− mostraron menos evitación social en un ratón CD-1 después de ECDS en comparación con los ratones WT → WT, según lo medido por la proporción Sl y el tiempo que el ratón experimental pasó en la esquina. Efectos similares se observaron cuando los ratones se evaluaron para la interacción social con un ratón juvenil del mismo sexo. De manera notable, no se observó ningún efecto de la disminución de MMP8 en los cambios en otros comportamientos relacionados con el estrés no sociales, como la prueba de preferencia por la sacarosa, la prueba de la salpicadura o el laberinto elevado en cruz. Tampoco se observaron diferencias en los comportamientos relacionados con la enfermedad, como el peso corporal, el consumo de alimentos o la locomoción general. Además, los ratones carentes de forma constitutiva (cKO) de Mmp8 no estresados no mostraron diferencias en la locomoción, la interacción social o las frecuencias de subpoblaciones de leucocitos en condiciones basales, pero, en línea con los datos de las quimeras de médula ósea Mmp8−/−, mostraron una proporción de interacción social más alta que indicó menos evitación social en comparación con los ratones de tipo salvaje emparejados por edad después de ECDS.
MMP8 regula el espacio extracelular (ECS) y la neurofisiología
Al final, se buscó evaluar si MMP8 se vincula a cambios en el espacio extracelular (ECS) y en la neurofisiología del núcleo accumbens (NAc). De nuevo, con microscopía electrónica de transmisión se evaluó en ratones estresados el volumen del ECS en el NAc y la corteza prefrontal (PFC). Se encontró que, en comparación con ratones WT → WT, los ratones Mmp8−/− → WT tenían un ECS reducido en el NAc (Fig. 4l), pero no hubo cambios en la PFC (Datos extendidos Fig. 9k). Dado que los cambios en el ECS cerebral y la reorganización de la matriz extracelular (ECM) mediada por MMP de manera previa se asoció con alteraciones en la fisiología neuronal, se realizaron registros de técnica de fijación en parche de membrana de células enteras ex vivo de neuronas espinosas medianas (MSNs) del NAc de ratones cKO y de tipo salvaje (Fig. 4m). Estudios previos mostraron que el estrés social por derrota crónica (ECDS) conduce a cambios neurofisiológicos en las MSNs del NAc de ratones susceptibles al estrés (SUS) pero no en los resistentes (RES), como un aumento en la excitabilidad neuronal intrínseca y una mayor frecuencia de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs). En línea con esta hipótesis, la disminución de Mmp8 atenuó el aumento de la excitabilidad neuronal inducida por el estrés (Fig. 4n, o) y las EPSCs espontáneas (Fig. 4p, q), sin afectar el potencial de membrana en reposo, el umbral de excitabilidad (rheobase) o la amplitud de las EPSCs espontáneas (Datos extendidos Fig. 9l–n).
Se demostró que el aumento inducido por el estrés en MMP8 periférica conduce a alteraciones en el espacio extracelular (ECS) del núcleo accumbens (NAc), asociado con una neurofisiología alterada del NAc y la evitación social (Datos extendidos Fig. 10). Se proporcionó evidencia de un mecanismo mediante el cual el sistema inmunológico periférico puede afectar la función neuronal y el comportamiento. Aunque varios estudios vincularon de manera causal factores inmunológicos periféricos como citocinas o diferentes tipos de células con alteraciones conductuales, se demostraron o hipotetizaron mecanismos que afectan de forma directa a las neuronas—por ejemplo, mediante la unión de citocinas a receptores expresados en neuronas. Aquí se demuestra una forma distinta en la que el estrés promueve las interacciones de células inmunitarias periféricas con el cerebro para controlar el comportamiento social—es decir, vía MMPs derivadas de células inmunitarias en circulación que afectan la función neuronal al cambiar de manera potencial el ECS. Se necesitan más estudios para manipular de manera específica diferentes componentes del ECS en varias regiones cerebrales, vincularlos con cambios conductuales y neurofisiológicos específicos, e identificar factores periféricos y centrales adicionales que afectan la homeostasis del ECS. Además, una pregunta que se debe abordar en estudios futuros es en qué punto el tráfico de monocitos específicos de la región permite la entrega local de factores secretados como MMP8. Al final, la disminución de MMP8 previno el comportamiento de evitación social después de ECDS, sin afectar los comportamientos no sociales. Se necesita más investigación para desentrañar los mecanismos neuroinmunes de las alteraciones conductuales inducidas por el estrés en comportamientos sociales versus no sociales. En conjunto, estos datos proporcionan información importante sobre el papel emergente de los mecanismos neuroinmunes en los trastornos neuropsiquiátricos, se destacaron nuevos objetivos periféricos para biomarcadores avanzados y opciones de tratamiento.
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario ¨Dr. José Eleuterio González¨ UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dr. C. Carlos Macouzet Sánchez Profesor
Dr. Evaristo Noe Lemus Reyner Residente de 1er año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesora
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