La farmacología de los péptidos relacionados con la bradicinina (BC), las cininas, avanzó mucho en las últimas décadas, con la definición farmacológica y luego molecular de los dos receptores acoplados a la proteína G (RAPG) que median sus acciones celulares, los receptores B1 y B2 (RB1, RB2). Las herramientas modernas adicionales de investigación incluyen cepas de ratón en las que uno o ambos genes que codifican los receptores de cinina se eliminan (modelos de “eliminación genética”). La formación de cininas y su degradación por peptidasas, tales como la enzima convertidora de angiotensina, no se tratan en el presente texto. El esfuerzo arduo de la bioquímica analítica de péptidos relacionados con la BC se describe en otro lugar. Se propone más bien una excursión a la farmacología de las cininas, ya que el primer autor es un espectador y un actor en el campo durante los últimos 40 años. Hay cierto sesgo autobiográfico en la selección del material de ilustración, ya que este grupo es activo en la exploración y el diseño de ligandos novedosos y en el estudio del receptor de cinina adaptado por medio de imágenes celulares.
Ligandos del receptor de bradicinina: agonistas y antagonistas
Los receptores de la bradicinina en sus inicios se definieron a finales de los años setenta y ochenta y para esto se utilizaron criterios farmacológicos. Según la historia, el RB1 fue el primero que se definió al utilizar un orden de potencia típico de agonistas y una clase de antagonistas específicos. Este subtipo de receptor algo atípico responde de forma óptima a fragmentos de las cininas nativas (BC y Lys-BC) en las que el residuo Arg9 se elimina de manera enzimática (des-Arg9-BC, Lys-des-Arg9-BC, de forma respectiva; figura 1). De manera frecuente se pasa por alto, el único agonista de la forma humana de RB1 que posee una afinidad subnanomolar es Lys-des-Arg9-BC, también llamado des-Arg10-calidina. Este péptido se genera a partir de Lys-BC (calidina), que a su vez se deriva de la escisión de los cininógenos por la calicreína tisular (producto del gen KLK1). Por lo tanto, el RB1 puede ser irrelevante para las condiciones asociadas con la calicreína plasmática hiperactiva (KLKB1), como el angioedema hereditario (AEH), ya que esta proteasa genera BC. Los primeros antagonistas de péptidos de RB1 eran de forma simple secuencias des-Arg9 en las que Phe8 se reemplazó con un residuo que posee una cadena lateral alifática, como Leu. En retrospectiva, ahora está claro que las cininas nativas producidas por las calicreínas, ya sea BC o Lys-BC, son agonistas selectivos del subtipo RB2 prominente de forma fisiológica y que se consolida con antagonistas de péptidos específicos creados en el laboratorio de J.M. Stewart en la década de 1980. Los antagonistas de RB2 de forma típica poseen una estructura peptídica restringida debido a la inclusión de aminoácidos no naturales voluminosos que también confieren resistencia a la inactivación por peptidasas (Figura 1). El icatibant (Firazyr®, Hoe 140) es un excelente prototipo de los antagonistas del péptido del RB2 explotados en cientos de estudios de ciencias básicas; en la actualidad está aprobado para el tratamiento de los ataques de AEH en autoinyector. El icatibant es de forma aparente un antagonista competitivo (superable) en el RB2 humano, pero el péptido puede ser insuperable y/o un agonista parcial en otras especies de mamíferos. La forma des-Arg9 del icatibant, aunque no es un metabolito espontáneo de este fármaco, es de forma predominante un antagonista del RB1, lo que demuestra que el diseño del péptido restringido también es viable en este subtipo de receptor; otros antagonistas de péptidos con especificidad alta de este tipo incluyen B-9958 (Figura 1). Como polímero policatiónico, el icatibant se identificó de manera reciente como un liberador directo de la histamina de las células cebadas por medio de un RAPG denominado MRGPRX2, lo que explica una reacción cutánea local y común en el lugar de la inyección subcutánea.
Los agonistas resistentes a peptidasa selectivos para cualquier tipo de receptor son herramientas de laboratorio interesantes, y uno de los agonistas selectivos del RB2 de esta categoría, B-9972 (Figura 1), tiene efectos distintivos sobre los ciclos del RB2 (véase más adelante). Otro agonista selectivo de RB2 resistente a carboxipeptidasas, labradimil (lobradimil, Cereport®, RMP-7; Figura 1), alcanzó el desarrollo clínico como adyuvante de la quimioterapia para tumores cerebrales.
En este caso, el efecto proinflamatorio de la BC se aprovechó de forma deliberada para abrir de manera temporal la barrera hematoencefálica. Sin embargo, un ensayo de labradimil como adyuvante del carboplatino no fue concluyente en niños con tumores cerebrales. Investigaciones preclínicas posteriores indican que un agonista del RB1 resistente a las peptidasas, Sar-Lys [D-Phe8] desArg9-BC, tiene un potencial superior para abrir la barrera hematoencefálica al nivel de los gliomas, donde se expresa de forma selectiva el RB1 en los sitios de lesión.
Se proponen modelos de acoplamiento para ligandos peptídicos y no peptídicos tanto para el RB1 como para el RB2. En particular, explican por qué el RB1 excluye los péptidos que poseen el residuo Arg9 y también algunas discrepancias entre especies, por ejemplo, el hecho de que la presencia de Lys en la posición “cero” es fundamental para una buena afinidad en la forma humana del RB1. Los modelos predicen que el extremo C de los ligandos se sumerge en la cavidad central del receptor, mientras que el extremo N permanece más cerca del líquido extracelular. A partir de estas premisas, el laboratorio de Lajos Gera desarrolló el conjunto completo de agonistas y antagonistas fluorescentes para ambos subtipos de receptores lo que prolonga su estructura en el extremo N-terminal con la fluoresceína emisora de verde o, para los ligandos del RB2, la emisora de infrarrojos Cy7 (Figura 1; véase también a continuación). Las mismas consideraciones de acoplamiento llevan a la hipótesis de que los agonistas BC o Lys-des-Arg9-BC pueden colocarse en el extremo C-terminal de las proteínas de fusión, separados por una secuencia espaciadora de una proteína funcional. La secuencia de anfibios maximacinina tiene la secuencia BC completa en el extremo C-terminal de una extensión hidrófila de 10 residuos (Figura 1); éste es un módulo espaciador-agonista suficiente para una fusión exitosa con la proteína fluorescente verde mejorada (PFVM): PFVM-maximacinina es un ligando agonista de afinidad alta del RB2 que apoyó los estudios de imagen celular. Otro espaciador sin carga pero hidrófilo, (Asn-Gly)15, se utiliza para crear el ligando fluorescente del RB1 humano, PFVM - (Asn-Gly) 15- Lys-des-Arg9-BC o combinado con maximacinina para producir APEX2- (Asn-Gly)15-maximacinina (Figura 1). APEX2 es una oxidasa diseñada compatible con los sistemas de detección, que se encuentra disponible de forma fácil para la detección histoquímica y óptica, lo que permite una detección directa de los RB2 de rata con este ligando enzimático. Sin embargo, una limitación de los ligandos basados en la secuencia de maximacinina fue su afinidad baja inesperada por la forma humana del RB2; se garantiza la optimización de la secuencia del espaciador. Esta línea de investigación define nuevas herramientas diagnósticas y analíticas alternativas a los anticuerpos.
De manera reciente se exploró otro tipo de ligandos del RB2: secuencias escindibles con afinidad baja por el receptor que liberan un agonista de afinidad alta después de la reacción con una peptidasa específica. El objetivo de este esfuerzo es extraer beneficios cardiovasculares de la estimulación controlada de RB2 endoteliales, como la vasodilatación, mientras se evitan los sitios de acción extravasculares donde un agonista produce efectos secundarios importantes (por ejemplo, terminales nerviosas aferentes, epitelio gastrointestinal o respiratorio). Los mejores prototipos validados in vitro e in vivo fueron BC-Arg y D-Arg0-BC-Arg-Arg, ambos sustratos de arginina-carboxipeptidasas (secuencias en la figura 1).
La industria farmacéutica desarrolló un gran número de antagonistas no peptídicos para ambos subtipos de receptores de la BC; se mencionarán sólo uno o dos para cada uno. El antagonista del RB2 anatibant (LF 16-0687; figura 1) se utilizó en un ensayo clínico para la prevención del edema cerebral después de un traumatismo craneoencefálico (ensayo no concluyente). El anatibant es una molécula pesada de forma relativa no adecuada para la administración oral; la biodisponibilidad oral y la potencia aumentada se alcanzaron en un prototipo reciente de antagonista de RB2, PHA-022121. Es probable que dicho fármaco mejore la calidad de vida de los pacientes con AEH. El desarrollo clínico de un antagonista del RB1 con penetración cerebral y biodisponible por vía oral, MK-0686, como analgésico se interrumpió después de que los ensayos sugirieron una falta de eficacia en la indicación del dolor inflamatorio. También otros esfuerzos en el desarrollo de antagonistas del RB1 para uso clínico son decepcionantes.. El efecto antiinflamatorio de los antagonistas de los receptores de la cinina, bien establecido en numerosos estudios preclínicos, no se evaluó en humanos, pero tiene un interés potencial considerable. Por ejemplo, en la enfermedad inflamatoria intestinal, los síntomas diarreicos son impulsados por ambos subtipos de receptores de la BC que median la secreción de cloruro y agua a nivel del epitelio intestinal. En el curso de estudios de estructura-actividad de antagonistas no peptídicos del RB2, los científicos de Fujisawa descubrieron varios agonistas parciales no peptídicos de este receptor. El compuesto 47a, ilustrado en la figura 1, es uno de ellos; tiene similitudes estructurales limitadas con el anatibant y es una herramienta interesante de laboratorio. Se modeló el acoplamiento de antagonistas no peptídicos a ambos subtipos de receptores de cinina.
Descripción general de la expresión y transmisión de señales de los receptores de bradicinina
En los genomas de mamíferos, los 2 genes que codifican BC, RB2 y RB1, denominados BDKRB2 y BDKRB1, de manera respectiva, se ubican uno al lado del otro, en tándem y en este orden (figura 2, marcador 1). En la región del cromosoma humano 14q32 representada de forma esquemática (de manera aproximada 70 kb, desde la posición 94.66 a 94.73 Mb), se muestran los 3 exones principales de cada gen (no de forma precisa a escala). La expresión del RB2 es constitutiva en un gran número de tejidos. El RB1 es un RAPG excepcional que es inducible en las células vasculares, sobre todo bajo la influencia de la lesión tisular, las citocinas y los sistemas de transmisión de señales mencionados en la figura 2. La inyección de lipopolisacárido bacteriano en animales de laboratorio, incluida una especie de primates, es un modelo tradicional para sensibilizar todo el sistema cardiovascular a los agonistas del RB1, con respuestas como hipotensión, vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular (figura 2, marcador 2). Esto se puede modelar a nivel celular: por ejemplo, el RB1aumenta de forma sinérgica en las células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) mediante el cotratamiento con el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el interferón-γ (IFN-γ). (mediciones de ARNm o ensayo de unión de radioligando, figura 2, marcador 3, gráfico de la derecha). Por tanto, la inducción del RB1 se regula de forma clara a nivel transcripcional, con concentraciones muy pequeñas en tejidos sanos, y extiende la respuesta del organismo a un espectro más amplio de metabolitos de cininas en función del tiempo y del estado fisiológico. Aunque la concentración celular del ARNm que codifica el RB2 a menudo varía en paralelo con la del RB1 en inmunopatología o en respuesta a citocinas (como en las CEVUH), el primer subtipo de receptor no parece estar muy regulado a nivel de transcripción, es posible, ya que la proteína del RB2 es constitutiva, reciclada y de larga duración, como se verá a continuación. También se observan poblaciones basales del RB1 en células cultivadas que se supone que están en reposo, como en los estudios de unión de radioligandos aplicados a células vasculares humanas, por ejemplo, en las CEVHU mantenidas en medio comercial de crecimiento de células endoteliales (figura 2, marcador 3). Sin embargo, parece ser un artefacto relacionado con la estimulación celular con suero, factores de crecimiento y condiciones de cultivo. La estimulación con varias citocinas (TNF-α, interferón-γ, interleucina-1, factor de crecimiento epidérmico, etc.) aumenta de forma clara la expresión y la función de la proteína del RB1 en estos modelos. Los estudios celulares demuestran que las glicoproteínas recién formadas del RB1 no transitan de manera fácil desde de la vía secretora hacia la superficie celular. La homooligomerización puede ser necesaria para la maduración del RB1; los antagonistas no peptídicos del RB1 que penetran en las células también facilitan la expresión superficial de los RB1 glicosilados, una forma de chaperón farmacológico. Además, la transición inflamatoria de la transmisión de señales del RB2 al RB1 se facilita por la formación de heterodímeros que conducen a la degradación proteolítica selectiva del socio del RB2.
Tanto el RB1 como el RB2 se acoplan de forma principal a la proteína G Gq, que activa una fosfoinositidofosfolipasa C-β que hidroliza el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato presente en la membrana plasmática en inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) + diacilglicerol (figura 2, marcador 4). Este último lípido permanece en la membrana y recluta varias isoformas de la proteína cinasa C que determinan de forma secuencial la activación de las cinasas MAP MEK/ERK y la expresión y fosforilación de c-Fos. El fosfosazúcar IP3 es el activador del receptor IP3 del retículo endoplásmico (RE) que es un canal de calcio dependiente del ligando de conducción alta. Por lo tanto, la estimulación de cualquiera de los subtipos del receptor de la BC libera de forma rápida las reservas de Ca2+ del RE para elevar las concentraciones de Ca2+ citosólico. Esto se evaluó mediante la variación de la fluorescencia FURA-2 leída a 510 nm bajo excitación a 340 nm en CEVEH cultivadas como se describió; las células se estimularon con BC con o sin una concentración máxima del antagonista del RB2 anatibant (resultados no publicados del laboratorio de los autores, figura 2, marcador 3, gráfico de la izquierda). Otros mecanismos pueden contribuir a la entrada tardía de Ca2+ desde el líquido extracelular a las células vasculares activadas.
El Ca2+ activa sistemas enzimáticos relevantes en las células endoteliales, ya sea de forma directa (fosfolipasa citosólica A2) o mediante su unión a calmodulina (óxido nítrico sintasa endotelial; miosina cinasa de cadena ligera, MCCL). Las moléculas mensajeras producidas por el endotelio, de las cuales el ON y la prostaglandina I2 son ejemplos principales, relajan las células del músculo liso arteriolar (figura 2, marcador 5), y aumentan la vasodilatación que es la base de los signos cardinales específicos de inflamación (rubor, calor). La activación mediada por MCCL de la contracción del citoesqueleto de actina-miosina conduce a la retracción de las células endoteliales, haciéndolas permeables, de forma particular a nivel de las vénulas poscapilares, y a la exocitosis de los cuerpos de Weibel-Palade que contienen P-selectina. Esto conduce a la extravasación de líquido, proteínas, y de manera final, células inflamatorias que sustentan el tumor, se refiere al edema tisular. Como las cininas estimulan los abundantes nervios aferentes que terminan presentes en los tejidos (por ejemplo, en las mucosas de las vías respiratorias), la inflamación neurogénica impulsada por la liberación antidrómica de neuropéptidos proinflamatorios y leucocitos tisulares que responden a ellos pueden amplificar el edema.
Los efectos proinflamatorios de los péptidos relacionados con la BC son en gran parte asimétricos, lo que favorece las manifestaciones vasculares del proceso sobre el reclutamiento de leucocitos; hay pocos efectos validados de las cininas sobre los leucocitos sanguíneos. El ratón que carece del gen RB1 exhibe un pequeño déficit de migración de fagocitos en sitios inflamatorios; este efecto puede ser vascular de manera principal ya que des-Arg9-BC aumenta la producción de quimiocinas en el endotelio, la explicación probable de la facilitación de la extravasación de neutrófilos mediada por el RB1.
Adaptación del receptor de la bradicinina
La función de adaptación del RB2 estimulado por agonistas es una característica típica de los RAPG en general, en el sentido de que sigue una secuencia bien documentada de eventos para varios otros receptores: un dominio rico en Ser/Thr de la cola C-terminal intracelular de la secuencia del RB2 se fosforila por varias cinasas RAPG; las 2 arrestinas no visuales (β-arrestina1 y 2) se asocian con el receptor fosforilado y compiten con la proteína G, lo que desensibiliza al receptor. Las proteínas adaptadoras y estructurales, que de manera probable incluyen AP-2 y clatrina en el caso del RB2, dirigen el receptor a un hoyo que puede salir de la membrana plasmática y adquirir las propiedades del endosoma temprano (figura 3, abajo, representación esquemática). Estos eventos pueden modelarse al usar receptores fluorescentes, arrestinas y ligandos en células HEK 293 (a) (figura 3, arriba). El RB2 de conejo fusionado con la proteína verde fluorescente (PVF) se transloca desde la superficie celular a endosomas múltiples y polimórficos en la estimulación de la BC; varios enfoques (microscopía, ensayos vinculantes, inmunotransferencias) muestran el reciclaje completo del receptor en 1 a 3 horas. Las β-arrestinas tienen una distribución citosólica suave en las células en reposo pero, en las células que expresan un RB2 no fluorescente que se estimulan más con la BC, la fluorescencia asociada con la proteína de fusión β-arrestina2-PVF se condensa en estructuras endocíticas (figura 3).
Otras células que expresan el RB2 no fluorescente pueden marcarse con el antagonista fluorescente B-10380 o el agonista CF-εACA-BC (estructuras peptídicas que se muestran en la figura 1, imagen confocal de células HEK 293a en la figura 3), pero la distribución subcelular de la fluorescencia es muy diferente. Mientras que el antagonista marca el RB2 en reposo de forma esencial en la superficie celular, el agonista fluorescente marca las estructuras endosómicas, la evidencia sugiere que parte del marcador de carboxifluoresceína del péptido se transfiere como una función de tiempo de la degradación endosómica del agonista en el citosol (figura 3). Por tanto, el RB2 transporta los ligandos agonistas al interior de las células y esto conduce a su degradación. Los estudios microscópicos en experimentos a corto plazo (periodos de incubación de 30 minutos con el agonista) apoyan de forma plena la colocalización de la tríada agonista-RB2-arrestina en los endosomas tempranos; Rab5 también se colocaliza en esta etapa. Luego, las proteínas fosfatasas desfosforilan los RB2, que están listas para reciclarse a la superficie celular (figura 3, abajo).
Evidencia reciente basada en fármacos que alteran el citoesqueleto y Rab GTPasas dominantes negativas (bloqueadas por PVF) señala que la progresión de la carga ligando-RB2-arrestina desde la superficie celular al espacio perinuclear depende de que el mediador Rab5 se desplace de forma temprana de los endosomas a lo largo de las fibras de tubulina y que el proceso de reciclaje es diferente por completo, depende de Rab4 y Rab11 y del citoesqueleto de la actina. La inactivación intraendosómica de la BC también es crítica para el transcurso del tiempo del reciclaje del RB2, como lo muestra un agonista peptídico resistente a la inactivación, B-9972, o un agonista parcial no peptídico, compuesto 47a (estructuras en la figura 1). La maximacinina homóloga de la BC de anfibios (figura 1) también actúa como agonista resistente a la inactivación. En todos estos casos, se observa poco o ningún reciclaje del RB2 en el período de incubación de 12 horas después de la estimulación celular, y se destruye una proporción considerable del receptor (evidencia de inmunotransferencia), se presume que es después de la progresión continua hacia el endosoma-lisosoma tardío (figura 3, abajo).
El RB1 tiene una cola C-terminal intracelular que no está bien conservada en la secuencia entre las especies de mamíferos y que es muy corta en algunas. En consecuencia, el RB1 no se fosforila con la estimulación agonista y no promueve la condensación de las β-arrestinas citosólicas a nivel endosomal o de la membrana plasmática (figura 3, arriba, resultados no publicados). Por lo tanto, los RB1 carecen del mecanismo básico de desensibilización del RB2 y puede transmitir señales durante períodos prolongados en algunos sistemas. Sin embargo, un descubrimiento inesperado basado en una proteína de fusión del RB1 de conejo con la proteína amarilla fluorescente (PAF) fue la translocación inducida por agonistas laterales del RB1 en estructuras que permanecen cerca del plano de la membrana plasmática (microscopía confocal, figura 3, arriba). Estas estructuras se rompen por la extracción de colesterol de las células y es probable que sean caveoladas, las series lipídicas que pueden determinarse en microscopía óptica. Esta opinión se respalda por el marcaje del RB1 de conejo o humano no fluorescentes mediante ligandos fluorescentes (figura 3; los RB1 humanos se ilustran mediante microscopía confocal). Mientras que el antagonista B-10376 en esencial marca los RB1 en reposo en la membrana plasmática de manera continua, el agonista B-10378 no tiene una distribución endosomal significativa, sino una ubicación bastante irregular en la membrana plasmática (figura 3, arriba; estructuras peptídicas en la figura 1).
Los estudios microscópicos apoyan que la caveolina-1 se colocaliza con B-10378 y con B1R-PAF estimulada por agonistas. Además, los estudios de fraccionamiento celular que tienen como objetivo recuperar series lipídicas flotantes relacionadas con caveolas de células premarcadas con un radioligando agonista o antagonista mostraron que la versión agonista está muy enriquecida en tales series, a diferencia del antagonista. Esto se aplicó tanto a células HEK 293 que sobreexpresan RB1-PAF como a células de músculo liso vascular humano cultivadas que expresan RB1 endógenos (datos no publicados del laboratorio). Las caveolas, prominentes de forma particular en las células endoteliales vasculares, son plataformas de transmisión de señales de interés donde se enriquece la proteína G Gαq, un socio de transmisión de señales del RB1.
Otra diferencia de interés notable entre los dos subtipos de receptores de la BC es su vida media aparente como proteínas maduras en la superficie celular. La discusión anterior sobre el ciclismo del RB2 deja en claro que se maneja de forma económica y es de larga duración. Como otros productos génicos inducidos durante condiciones inflamatorias (por ejemplo, óxido nítrico sintasa inducible), el RB1 es de corta duración (vida media de 2-4 horas), y se elimina de la superficie celular de una manera independiente del ligando (representación esquemática, figura 3, abajo). Esta diferencia de vida media se estableció tanto para los receptores recombinantes como para los expresados de forma natural. Se argumentó que la transmisión de señales de los RB1 estimulados por agonistas depende de esta endocitosis irreversible, un fenómeno transitorio de manera esencial.
Algunas cuestiones moleculares importantes no se discuten en esta revisión, como los modos adicionales de heterodimerización del receptor o el desarrollo de agonistas parciales, debido a la naturaleza incierta de los hallazgos limitados reportados aplicados a los RB1 y RB2. Basta decir que B-9972 se comporta como un agonista parcial de forma aparente del RB2 ya que cambia la cinética del ciclo del receptor (véase más arriba).
Conclusiones
Las cininas surgieron como mediadores inflamatorios, implicados de forma particular en el desarrollo de los signos cardinales de la inflamación que dependen de las respuestas vasculares (vasodilatación, aumento de la permeabilidad microvascular).. A pesar de la madurez de los esfuerzos de la química médica encaminados a antagonizar los receptores de la BC, las aplicaciones clínicas son limitadas, y en la actualidad el AEH es el escaparate del sistema de calicreína cinina en la terapéutica humana. De hecho, el antagonista del RB2 icatibant y los inhibidores de la calicreína plasmática ecalantida y lanadelumab se utilizan ahora en la clínica para esta indicación y se encuentran varios productos en investigación relacionados con el sistema calicreína-cinina. A pesar del efecto analgésico decepcionante de los antagonistas del receptor de la BC en los seres humanos, vale la pena seguir otras vías terapéuticas en aplicaciones como la inflamación. Otras áreas que requieren investigación incluyen los posibles efectos saludables de las cininas endógenas en la circulación, en especial durante situaciones estresantes como isquemia, lesión renal y quizás hipertensión; los agonistas terapéuticos del receptor de la BC resultan útiles en tales situaciones. Por el contrario, los efectos secundarios accidentales y catastróficos de los antagonistas de la BC surgen en individuos para quienes las cininas son compensatorias. En conclusión, a pesar de la gran cantidad de trabajo para obtener una mejor comprensión de la farmacología de los receptores de la BC, queda mucho por descubrir.
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