1. Introducción
Además de la BC, varios mediadores vasoactivos pueden modular la permeabilidad vascular y desempeñar un papel en la fisiopatología del AEH-INH-C1. Por ejemplo, los factores de crecimiento endotelial vascular (FCEV), producidos por células endoteliales y varias células inmunes circulantes modulan la permeabilidad vascular. Por ejemplo, el FCEV-A es un vasodilatador potente por medio de la liberación de óxido nítrico. Una vía endotelial complementaria que regula la función de la barrera vascular es la angiopoyetina (ANGPT). La ANGPT2 promueve la permeabilidad vascular, mientras que la ANGPT1 favorece la estabilización endotelial. También la superfamilia de la fosfolipasa A2 (FLA2), incluida la FLA2 secretada (sFLA2) y la acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas (AH-FAP), puede modular de manera directa la permeabilidad vascular. La familia AH-FAP comprende enzimas extracelulares e intracelulares. En particular, la enzima de tipo plasmático o extracelular se encuentra asociada con la lipoproteína y cataliza la desacetilación e inactivación del FAP. También muestra una función antiinflamatoria mediante reducciones marcadas en la fuga vascular inducida por el FAP. De forma reciente se describió que los niveles plasmáticos de FCEV-A, FCEV-C, ANGPT1, ANGPT2 y sFLA2, en particular grupo 2A (FLA2G2A), se encuentran alterados en pacientes con AEH-INH-C1 durante el período de ausencia de síntomas. De manera interesante, las actividades de la sFLA2 disminuyen durante los ataques de angioedema. Hasta la fecha, no hay datos sobre el papel de FCEV, ANGPT y AH-FAP durante los ataques de angioedema.
Incluso si la patogenia del AEH-INH-C1 está bien descrita, los mecanismos subyacentes a la evolución y resolución de los ataques de angioedema son en gran parte son desconocidos. En este estudio se analizaron las concentraciones plasmáticas de FCEV y ANGPT y la actividad plasmática de la AH-FAP en los pacientes AEH-INH-C1 durante los ataques de angioedema con el fin de iluminar el conocimiento sobre este fenómeno.
2. Materiales y métodos
2.1 Muestra de sangre
Se extrajo sangre durante los procedimientos de diagnóstico de rutina y la muestra de plasma restante se etiquetó con un código que se documentó en una hoja de datos. Los técnicos que realizaron los ensayos se cegaron a la historia de los pacientes. Las muestras se recolectaron mediante una venopunción limpia y una estasis mínima con citrato de sodio a 3.2% como anticoagulante. Después de la centrifugación (2,000 g durante 20 min a 22°), el plasma se dividió en alícuotas y se almacenó a -80°C hasta su uso.
2.2 Población de estudio
Se estudiaron 51 pacientes adultos con AEH-INH-C1 en remisión y 31 controles sanos seguidos en la Universidad de Nápoles Federico II (Nápoles, Italia) y la Universidad Semmelweis (Budapest, Hungría).. Las características clínicas se reportan en la Tabla complementaria 1.. El Comité de Ética de la Universidad de Nápoles Federico II (protocolo número: 216/16) y la Universidad Semmelweis de Budapest (protocolo número: BPR/021/09599-7/2014) aprobó que el plasma obtenido durante los diagnósticos de rutina podría utilizarse para la investigación de la fisiopatología del angioedema hereditario y se obtuvo por escrito el consentimiento informado de los pacientes de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El diagnóstico de AEH-INH-C1 se basó en presencia de al menos un criterio clínico y de laboratorio. Quince pacientes de 51 se siguieron también durante el ataque de angioedema agudo y sus características clínicas específicas se reportan en la Tabla 2 Suplementaria. Respecto a las muestras asintomáticas, se realizó extracción de sangre al menos dos semanas desde la fecha del último ataque de angioedema. Con respecto a las muestras durante el ataque, la extracción de sangre se realizó dentro de 6 horas después del inicio de los síntomas.
2.3 Análisis del sistema de complemento
El plasma INH-C1 se midió mediante inmunodifusión radial (NORPartigen, Siemens Healthcare Diagnostics, Munich, Alemania). La concentración de antígeno C4 en Italia se midió mediante inmunodifusión radial (NOR-Partigen) (el método no es específico para los fragmentos C4); en Hungría C4 se midió por turbidimetría (Roche Cobas Integra 800, Complemento Beckman Coulter C4). El anticuerpo empleado en el ensayo Beckman Coulter C4 se dirige contra la porción común de la molécula C4 y exhibe la misma reactividad con los fragmentos C4, así como con la molécula nativa. La función del INH-C1 se evaluó como la capacidad del plasma para inhibir la actividad esterasa de los C1 exógenos medido en un sustrato cromogénico específico por medio de un kit disponible de forma comercial (Technoclone GmbH, Viena, Austria). Los rangos de referencia fueron 0.70-1.30 U INH-C1/ml (1 U INH-C1 corresponde a la actividad media del INH-C1 presente en 1 ml de plasma normal fresco citrado). La actividad funcional del INH-C1 también se expresó como un porcentaje de actividad del INH-C1 presente en las muestras. Los valores normales de la actividad del INH-C1 son superiores a 0.7 U C1 INH/ml (>70%). Según los criterios diagnósticos, todos los pacientes incluidos en este estudio tenían actividad funcional del INH-C1 inferior a 50%, antecedentes familiares positivos, síntomas clínicos de angioedema, C4 bajo, concentraciones normales de C1q.
2.4 Ensayos de FCEV y ANGPT
Los niveles plasmáticos de FCEV-A, FCEV-C, FCEV-D, ANGPT1 y ANGPT2 se midieron con kits ELISA disponibles de manera comercial (R&D System, Minneapolis, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. La sensibilidad de ELISA es de 31.1 a 2,000 pg/ml para FCEV-A, 62.5 a 4,000 pg/ml para FCEV-C, 31.3–2,000 pg/ml para FCEV-D, 156.25–10,000 pg/ml para ANGPT1 y 31.1–4,000 pg/ml para ANGPT2.
2.5 Ensayos de fosfolipasas
La actividad de FLA2 en el plasma de pacientes con AEH-INH-C1 durante la remisión y los ataques de angioedema se evaluó con un kit disponible de forma comercial (Ensayo de fosfolipasa A2 Life Technologies EnzChek®) de acuerdo con instrucciones del fabricante. La actividad de las enzimas AH-FAP se determinó en plasma de pacientes y controles sanos mediante el uso de kits de ensayo de AH-FAP (Cayman Chemical) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2.6. Análisis estadístico
Los datos se analizaron con el paquete del programa GraphPad Prism 7. Se probó la normalidad de los datos con la prueba de normalidad D'Agostino-Pearson. Si la normalidad no se rechazaba a un nivel de significancia de 0.05, se usaron pruebas paramétricas. De lo contrario, para los datos que no se distribuyen de manera normal se usaron pruebas no paramétricas. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de dos colas pareada o la prueba de Mann-Whitney de dos colas como se indica en las leyendas de las figuras. Se evaluó la correlación entre dos variables mediante análisis de correlación de rango de Spearman y se reportó como coeficiente de correlación (r). Las concentraciones plasmáticas de FCEV y ANGPT, la actividad de FLA2 y AH-FAP se muestran como la mediana (línea negra horizontal), percentiles 25 y 75 (cajas) y percentiles 5 y 95 (bigotes) de pacientes con AEH-INH-C1y controles. Las diferencias significativas de manera estadística se aceptaron cuando el valor de p era ≤ 0.05.
3. Resultados
3.1 Concentraciones de FCEV y ANGPT en pacientes con AEH-INH-C1 durante un
ataque de angioedema
Las características de los pacientes con AEH-INH-C1 y controles sanos se reportan en la Tabla Complementaria 1, mientras que la Tabla Complementaria 2 reporta las características del AEH-INH-C1 evaluadas durante el ataque de angioedema. Se evaluaron las concentraciones plasmáticas de diferentes factores de permeabilidad en los pacientes con AEH-INH-C1 durante un ataque de angioedema y en remisión. Las concentraciones de FCEV-A (Figuras 1 y 2A) no se alteraron durante los ataques agudos en comparación con los períodos sin síntomas [sin ataque 1 (0–8) frente a ataque de angioedema 1 (0–10) pg/ml valores medios (rangos intercuartílicos)]. Del mismo modo, no se encontraron modificaciones en los niveles de ANGPT2 durante los episodios de angioedema [185 (0-479) vs 170 (0-460) pg/ml] (Fig. 1B). Por el contrario, se detectó un aumento significativo de las concentraciones de ANGPT1 durante la fase de ataque agudo en comparación con fase de remisión [1578 (799–3052) vs 2518 (1096–6228) pg/ml] (Figura 1C). Además, la relación ANGPT2/ANGPT1 se redujo en fases agudas en comparación con los períodos sin síntomas [0.09 (0-0.49) vs 0.06 (0–0.33)] (Fig. 1D). Las concentraciones del factor linfangiogénico FCEV-C durante la fase aguda fueron similares a las de la remisión [341 (164–613) vs 358 (196–1042) pg/ml] (Fig. 1E). No se reportaron datos previos sobre el papel del FCEV-D, otro factor linfangiogénico, en pacientes con AEH-INH-C1. A diferencia del FCEV-C, las concentraciones del FCEV-D no aumentaron en 51 pacientes con AEH-INH-C1 en comparación con 31 controles sanos [sanos 36 (12-91) vs remisión 29 (0-144) pg/ml] (Fig. 1F). Además, no se encontraron diferencias en los niveles de FCEV-D en pacientes con AEH-INH-C1 durante los ataques de angioedema en comparación con los períodos sin síntomas [27 (0-144) versus el ataque de angioedema 30 (3-146) pg/ml] (Fig. 1G).
De manera interesante, cuando se estratificó el grupo de estudio según la frecuencia de ataque (<12 o ≥12 ataques/año) se observó, de manera similar a la fase libre de ataque, una tendencia creciente en pacientes con frecuencia alta (≥12/año) en comparación con pacientes con frecuencia baja (<12/año) para FCEV-A (Sup. Fig. 1A), FCEV-C (Sup. Fig. 1B), ANGPT2 y la relación ANGPT2/ANGPT1 (Sup. Fig. 1C y 1D).
3.2. Actividad de AH-FAP en pacientes con AEH-INH-C1 durante un ataque de angioedema
De forma reciente, se demostró que los niveles de la actividad plasmática de sFLA2 y FLA2G2A aumentan en pacientes de AEH-INH-C1 sin síntomas en comparación con controles. En este estudio se evaluó la actividad plasmática de la AH-FAP de 51 pacientes con AEH-INH-C1 en remisión y en 31 controles sanos. De manera particular, la actividad de la AH-FAP aumentó en pacientes con AEH-INH-C1 en período sin síntomas en comparación con los controles [valores de mediana de 25 (0-46) sanos frente a 34 (0-54) nmol/min/ml sin ataque (rangos intercuartílicos)] (Figura 2A). No se encontró correlación entre las actividades de sFLA2 y AH-FAP (r = 0.03; NS). Se demostró que los estrógenos disminuyen los niveles plasmáticos de la AH-FAP en ratas adultas machos y hembras, mientras que las progestinas tienen el efecto contrario. Sin embargo, no se encontraron diferencias en la actividad de AH-FAP entre hombres y mujeres tanto en los controles como en los pacientes. Además, no hubo correlación entre la edad y la actividad de la AH-FAP tanto en los pacientes como en los controles sanos (datos no mostrados).
En los pacientes con AEH-INH-C1, los niveles funcionales de INH-C1 están por debajo de 50% del valor normal y las concentraciones de C4 se reducen por lo general y pueden utilizarse como prueba de escrutinio. Se investigó si las diferencias en los niveles de los componentes del complemento (INH-C1 y C4) se asociaron con las diferencias en la actividad de la AH-FAP. La actividad del INH-C1 no se correlacionó con la actividad de la AH-FAP (r = 0.01; NS) (Sup. Fig. 2A). Además, cuando se clasificaron los pacientes con AEH-INH-C1 de acuerdo con sus concentraciones de INH-C1 y C4 (menos de 25% o 25-50% de los valores normales), no se encontraron diferencias en la actividad plasmática de la AH-FAP entre estos grupos (datos no mostrados) (Supp. Fig. 2B y C).
Cuando se evaluó la actividad de la AH-FAP en pacientes con menos (frecuencia baja) o más (frecuencia alta) de 12 ataques en los últimos 12 meses, se encontró que la actividad de la AH-FAP se incrementó en pacientes más graves (Figura 2B). Luego, se examinó la relación entre la actividad de la AH-FAP y las concentraciones de FCEV y ANGPT. La actividad de AH-FAP no se correlacionó con FCEV-A (Supp. Fig. 3A), FCEV-C (Supp. Fig. 3B) y concentraciones de ANGPT1 (Sup. Fig. 3C). Por el contrario, las concentraciones de ANGPT2 y la relación de ANGPT2/ANGPT1 se correlacionaron de forma inversa con la actividad de la AH-FAP (Fig. 2C y D).
En una serie final de experimentos, se midió la actividad de la AH-FAP en 15 pacientes con AEH-INH-C1 durante la remisión y durante los ataques de angioedema. Se encontró que la actividad de la AH-FAP se redujo en pacientes durante los ataques en comparación con las condiciones basales [sin síntomas 32 (25-39) vs ataque de angioedema 19 (16-25) nmol/min/ml] (Fig. 2E).
4. Discusión
El AEH-INH-C1 es una enfermedad autosómica caracterizada por recurrencia ataques de edema sin fóvea asociados con morbilidad y mortalidad. El ataque de edema es un evento impredecible que se caracteriza por un aumento de la permeabilidad vascular y el consiguiente edema de la piel, el tracto gastrointestinal y las vías respiratorias superiores que se resuelve en 48 a 96 horas. Los ataques de angioedema se asocian con niveles plasmáticos reducidos del C1- INH que conduce a la activación de la activación de contacto que dispara niveles altos de BC. La frecuencia y la gravedad de los síntomas ocurren con variabilidad intra e interpaciente y el mecanismo que gobierna esta variabilidad no se comprende por completo. Se hace evidente que varios factores intervienen durante el ataque agudo como el CPMA escindido, marcadores de activación de las CE y FLA2G2A, además de la BC. De manera previa, se reportó que los niveles plasmáticos de FCEV-A, FCEV-C, ANGPT1 y ANGPT2 aumentan en pacientes con AEH-INH-C1 durante la remisión en comparación con los controles sanos, lo que contribuye a crear una especie de “preacondicionamiento vascular” que puede predisponer al ataque de angioedema. En cambio, el escenario durante el ataque de angioedema parece ser diferente por completo.. En este estudio, no se encontraron diferencias en los niveles de FCEV-A y ANGPT2 durante un ataque agudo en comparación con la remisión. De forma particular, se detectó un aumento significativo de ANGPT1 durante ataque de angioedema. ANGPT1 es un agonista del receptor Tie2 y desempeña un papel importante en la estabilización vascular. De manera reciente, se reportó que la mutación sin sentido del gen ANGPT1 se asocia a un nuevo endotipo de angioedema. La mutación conduce a una unión reducida de ANGPT1 a su receptor Tie2 causada por una falta de formación de multímeros de ANGPT1 que resulta en desestabilización vascular. Los datos de este estudio sugieren que ANGPT1, un estabilizador vascular único, puede desempeñar un papel importante en la restauración de la homeostasis vascular fisiológica durante el ataque de angioedema. Esta hipótesis se respalda de manera indirecta por la disminución de la relación ANGPT2/ANGPT1, que es un índice de permeabilidad vascular.
El sistema linfático se constituye por vasos y ganglios linfáticos y forma sistema vascular un elaborado que drena los fluidos de los tejidos del cuerpo. Los vasos linfáticos mantienen el equilibrio de líquidos en los tejidos al devolver el líquido linfático filtrado al torrente sanguíneo. Ellos interactúan con los vasos sanguíneos y desempeñan funciones importantes en el drenaje del líquido intersticial, absorción de lípidos y respuestas inmunitarias. La linfangiogénesis, el crecimiento de vasos linfáticos de vasos preexistentes, se apoya por factores linfangiogénicos como FCEV-C y FCEV-D. En el pasado se demostró que las concentraciones de FCEV-C aumentaron en pacientes asintomáticos con AEH-INH-C1 y aumentaron aún más en pacientes con AEH-INH-C1 más grave. En este estudio, se encontró que las concentraciones de FCEV-D, a diferencia de FCEV-C, no se alteraron en los pacientes asintomáticos AEH-INH-C1 en comparación a controles saludables. Ni FCEV-C ni FCEV-D se alteraron en el ataque de angioedema en comparación con la fase de remisión. Estos resultados indican que dos factores linfangiogénicos (es decir, FCEV-C y FCEV-D) se comportan de manera diferente entre ellos en fase de remisión y durante el ataque de angioedema.
Las concentraciones plasmáticas de FCEV y ANGPT2 en remisión son mayores en los pacientes con AEH-INH-C1 que experimentan más de 12 ataques por año que en aquellos que tuvieron menos de 12 ataques. De forma interesante, a pesar de que los niveles de FCEV-A, FCEV-C y ANGPT2 no parecen encontrase alterados durante el ataque de angioedema en comparación con la remisión, la división de la población de este estudio durante un ataque de angioedema basado en la frecuencia del ataque parece mantener de manera marcada una fuerte diferencia de tendencia entre los pacientes que experimentan menos de 12 ataques/año y más de 12 ataques/años. Estos hallazgos apoyan la correlación de FCEV y ANGPT con el fenotipo de la enfermedad en diferentes fases de la enfermedad.
La generación local de BC se considera el mediador central de la fuga vascular en los ataques de edema relacionados con el AEH-INH-C1. No se conoce de forma clara si la generación de BC es suficiente para causar un ataque de angioedema o se requieren otros mecanismos. La BC induce la producción de varios factores de permeabilidad vascular y enzimas, como la FLA2 y el FAP por las células endoteliales. La superfamilia de la FLA2 modula de manera directa la migración de células endoteliales y la permeabilidad vascular in vitro y comprende diferentes proteínas que incluyen la AH-FAP. La AH-FAP degrada no sólo al FAP sino también a fosfolípidos fragmentados de forma oxidativa con actividades biológicas potentes y es el objetivo de muchos estudios clínicos en enfermedades inflamatorias, como asma, sepsis y enfermedades vasculares. En este estudio, se encontró que los pacientes con AEH-INH-C1 en remisión aumentan la actividad de la AH-FAP en comparación con los controles sanos. De manera interesante, la actividad plasmática de la AH-FAP es incluso mayor en pacientes con AEH-INH-C1 que experimentan más de 12 ataques por año que en aquellos que tenían menos de 12 ataques. De manera similar a la sFLA2, se observó una disminución de la actividad de la AH-FAP durante el ataque de angioedema. La explicación de esta observación aún no está clara. Es concebible que la actividad disminuida de la AH-FAP pueda deberse a su agotamiento con el fin de degradar el FAP y otros metabolitos liberados durante el ataque de angioedema o su secuestro (unión a la superficie y/o internalización), de manera similar a otras sFLA2, por células endoteliales activadas durante la fase aguda. Cualesquiera que sean los mecanismos, las alteraciones de la AH-FAP tanto durante la remisión como en el ataque, sugieren una posible participación de este mediador en el AEH-INH-C1.
En conjunto, los resultados añaden información importante al conocimiento sobre el papel de los mediadores vasoactivos implicados de forma probable en la fase aguda del AEH-INH-C1. Parece que varios factores de permeabilización, como como FCEV-A, FCEV-C, ANGPT2, FLA2G2A y AH-FAP, junto con la BC, pueden actuar sobre el endotelio y mejorar un preacondicionamiento vascular para fuga. Se puede observar un escenario diferente durante el ataque de angioedema, cuando varios factores de permeabilidad (es decir, FCEV-A, ANGPT2) permanecen sin cambios. Por el contrario, ANGPT1, un estabilizador vascular, aumenta, y un inhibidor de factores vasodilatadores (es decir, AH-FAP), disminuye durante el ataque.
En conclusión, estos resultados destacan la complejidad por la cual varios de los mediadores vasoactivos se implican no sólo en la fisiopatología del AEH-INH-C1, sino también en la resolución del aumento de la permeabilidad vascular durante el ataque de angioedema.
Hereditary angioedema attack: what happens to vasoactive mediators?
Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. Hilda Hernández Sánchez Profesor
Dra. Wendy Jarely Santos Fernández Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann Profesor
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