1
| INTRODUCCIÓN
El huevo (H) es
una fuente frecuente de reacciones alérgicas mediadas por la IgE en los alimentos
en la infancia, en especial para 1.2% de los europeos en los primeros 2 años de
vida. La clara de huevo (CH) se considera la principal culpable con sus cuatro
alérgenos (ovomucoide−OVM, Gal d 1; ovoalbúmina−OVA, Gal d 2; ovotransferrina, Gal
d 3 y lisozima, Gal d 4) y la yema de huevo (YH) que incluye dos alérgenos,
α-livetina (Gal d 5) e YGP42 (Gal d 6). Algunas otras proteínas de la CH, la YH
o ambas se reportaron como reactiva a la IgE en estudios separados, lo que
dificulta la deducción en su participación relativa.
Queda claro que
existen dos fenotipos clínicos de alergia al huevo. Algunos niños toleran el
huevo en los productos horneados, su pronóstico es mejor y la introducción del
huevo horneado en la dieta aumenta su calidad de vida; aún se debate si esto
acelera la adquisición de la tolerancia. En tanto a los retos orales, uno se
realizó con la CH o el H crudo/pasteurizado y el otro con la CH del huevo duro
o del huevo horneado, lo que estableció el fenotipo. El uso de productos
pasteurizados, para evitar el riesgo potencial de infecciones, se respalda por
estudios que reportan que se mantuvo su capacidad de unión a la IgE o de
alergenicidad. Los sujetos reactivos al huevo horneado tienen pruebas cutáneas
por punción (PCP) más grandes y niveles mayores de la IgE específica a CH, OVA
y OVM, que los sujetos tolerantes al huevo horneado, pero con una gran cantidad
de superposición. Aún faltan establecer los límites de la IgE específica y las PCP
para diagnosticar la alergia al huevo horneado. Todos estos marcadores se basan
en un nivel de respuesta a una fracción o a un antígeno. La hipótesis es que la
respuesta relativa puede diferenciar a los pacientes que toleran el huevo horneado.
Se investigó de manera prospectiva la heterogeneidad de las respuestas relativas
a las fracciones del huevo o los antígenos en una cohorte de niños alérgicos al
huevo y se probó su relación con el fenotipo histórico.
2
| MATERIAL Y METODOS
2.1
| Participantes
Los investigadores
reclutaron niños (de 18 meses a 7 años) con alergia al huevo para participar,
previo consentimiento informado de la investigación n°2008‐A01403‐52 aprobada
por el Comité de Ética de Toulouse II (Francia). Se caracterizó el fenotipo
histórico a partir de su práctica actual, se recopilaron datos clínicos y se realizaron
las PCP con fracciones de huevo preparadas de forma especial, controles
negativos y positivos (fosfato de histamina, 10 mg/ml) y extractos comerciales
de la CH y aeroalérgenos (D. Pter, D. Far,
Dactyle, Phleole, Alternaria, gato y perro) de Stallergen (Antony, Francia). Para la mayoría de los niños, el suero
se analizó para determinar la IgE total y específica a la CH y la YH por ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Suecia) y se
almacenó a -80°C para exploraciones adicionales.
2.2
| Fracciones de huevo para PCP
Las fracciones
crudas y duras (94°C‐18 min) se prepararon con una separación cuidadosa para
evitar cualquier contaminación cruzada. Los huevos comerciales pasteurizados
(66 °C, 6 min) y la clara de huevo (56°C, 6 min) fueron de ABCD (Ploermel, Francia). Para cada paciente, las alícuotas (H, YH
y CH sin procesar; H y CH pasteurizadas; H, YH y CH hervidas duras) preparadas
en condiciones estériles se congelaron y se mantuvieron a -20°C en los centros
clínicos. Se proporcionan detalles adicionales en la información de respaldo
del artículo, apéndice S1.
2.3
| Proteínas CH y fracciones YH para ELISA
La ovalbúmina, la ovomucoide,
la proteína de unión a la riboflavina y la ovomucina se purificaron a partir de
la CH. La lisozima, la avidina y la ovoalbúmina‐X (Ova‐X) fueron de Liot (Béthune, Francia) y la ovotransferrina
de Especialista de huevo en polvo (Occhiobello,
Italia). El plasma y los gránulos separados por centrifugación a partir de la YH
en bruto se dividieron en dos subfracciones (LDL y livetinas de plasma, HDL y
fosvitinas de gránulos) como se describió antes.
Las
concentraciones de la IgE total y específicas en los sueros se determinaron
mediante F-ELISA24 con la estación de trabajo de automatización de laboratorio
Biomek® NXP (BECKMAN Coulter, Villepinte, Francia). Las proteínas o fracciones
se recubrieron a 5-20 µg/ml en tampón de carbonato o PBS, y los sueros se diluyeron
de 1:10 a 1:50.
2.4
| Análisis de los datos
En las PCP el
diámetro de roncha que se consideró positivo fue por encima de 3 mm o 50% del
control positivo. Se calculó la reactividad relativa de las PCP (el diámetro para
una muestra cruda/suma de diámetros para las tres muestras crudas) y las
variaciones en el tratamiento térmico (diámetro para una muestra calentada/diámetro
para la muestra en bruto correspondiente) en los pacientes. El error estándar medio
± se dio en el texto.
Los datos se
analizaron con el uso del programa GraphPad Prism 5.04 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.) Con un nivel
significativo que se estableció en 0.05. Los datos a menudo no demostraron una
distribución normal y las medianas se compararon mediante las pruebas de Kruskal-Wallis/Friedman
con las pruebas posteriores de Dunn o las pruebas de Mann-WhitnYH/Wilcoxon. A
menos que se indique lo contrario, en las figuras se muestran datos
individuales con barras para la mediana o datos de clase con caja y bigotes
(percentiles 10‐90). La clasificación jerárquica ascendente (HAC; método de
Ward) se usó para evidenciar patrones subyacentes. HAC, las tablas de
contingencia entre clasificaciones y su análisis mediante la prueba de χ2
cuadrado se realizaron con XLSTAT 2013.2.04.
3
| RESULTADOS
3.1
| Población de estudio
Se reclutaron cincuenta
y cuatro niños (39 niños, 3.8 ± 1.7 años); sus características y los datos
clínicos se presentan en la Tabla S1. La urticaria aguda resultó ser el síntoma
más frecuente con huevos crudos y cocidos. La dieta de exclusión actual se
recolectó para 49 niños; 49, 39 y 33 niños evitaban los huevos crudos, cocidos
y horneados, de forma respectiva. Treinta y cinco y 22 niños sufrían de otras
alergias alimentarias o alergias respiratorias. Dieciséis niños mostraron
sensibilización a los ácaros del polvo (D.
Pter y D. Far), 11 y 9 a Dactyle y Phleole, 11 y 7 al gato y al perro y 2
a Alternaria.
3.2
| Reactividad de las PCP hacia el huevo crudo y sus fracciones
Todos los niños
tuvieron las PCP positivas para el H y la CH crudos y 39 (72%) para la YH cruda
(Figura 1A). Las medias de los diámetros positivos fueron 9.8 ± 5.2 mm para H,
8.8 ± 5.1 mm para la YH y 12.6 ± 7.0 mm para la CH. La media para el extracto comercial
de la CH (7.3 ± 4.5 mm, 52 positivo) es inferior de manera significativa a la
del H o la CH sin procesar.
Las reactividades
relativas por paciente mostraron una gran dispersión de datos (Figura 1B) y la
clasificación jerárquica ascendente resultó en 3 clases (Figura 1C). Los 15
niños sin reactividad a la YH se reunieron en la primera clase (clase% crudo-1;
28%). La mayoría de los niños (33/54) reaccionaron a las 3 fracciones crudas
con una menor reactividad a la YH y una mayor a la CH (clase% crudo-2; 61%).
Seis niños se separaron en una tercera clase (clase% crudo-3; 11%), mostraron
una mayor reactividad a la YH que al H o a la CH. Los diámetros de las PCP con H
crudo se mostraron similares entre las tres clases (p = 0.06), los diámetros con la YH cruda diferían de manera
significativa entre la primera clase (nula) y los otros dos (7.6 ± 0.6 mm; 15.2
± 3.3 mm; p <0.001), y los
diámetros con la CH en cruda diferían de manera significativa (p <0.001) entre la segunda clase (15.4
± 1.2 mm) y los otros dos (8.3 ± 1.2 mm; 7.7 ± 2.2 mm).
3.3
| Variaciones de la reactividad de las PCP con el calentamiento
La Figura 2A
muestra las variaciones individuales de las PCP por fracción con tratamientos
térmicos. La pasteurización tuvo un efecto que se limitó en el diámetro de las PCP,
excepto en cuatro y tres niños que tuvieron PCP nulas con el H y la CH
pasteurizada, de manera respectiva. Las medias de diámetros positivos (9.1 ±
4.2 mm y 10.6 ± 6.3 mm, de manera respectiva) disminuyeron de forma ligera en
comparación con las fracciones en crudo. La cocción dura tuvo un efecto mayor
en los diámetros de las PCP. Para la YH, 15 niños tuvieron las PCP positivas
(28% de la cohorte, 38% de niños positivos a YH en crudo) y la media de
diámetros positivos disminuyó a 4.9 ± 2.1 mm. Para el H y la CH duros, de
manera respectiva, 31 (57%) y 36 (67%) niños todavía tuvieron PCP positivas.
Las medias de estos diámetros positivos (9.2 ± 5.6 mm para H y 10.8 ± 5.6 mm
para CH) no mostraron cambios significativos en comparación con el H y la CH
pasteurizados.
Para cada
tratamiento, la clasificación jerárquica ascendente en variaciones individuales
dio como resultado 2 clases (Figura 2B). La pasteurización del H o la CH no
tuvo impacto en la reactividad de las PCP para 34 niños en clase pasado-1 (63%)
pero disminuyó de forma significativa la reactividad para 20 niños en clase
pasado-2. Los niños en la clase pasado-1 fueron mayores que los niños en la clase
pasado-2 (p < 0.01) pero no
difirieron de manera importante en la reactividad de las PCP con fracciones en
crudo (p = 0.90, 0.97, 0.06 para H, YH
y CH; Fig. S1A).
Los niños que
mantuvieron cierta reactividad a las fracciones crudas se reunieron en la clase
HB-1 (n = 37.69%) al contrario que
los niños de la clase HB-2 que no mostraron reactividad a las tres fracciones crudas.
Los niños en la clase HB‐1 no difirieron en edad (p = 0.84), ni en la reactividad en la PCP al E (p = 0.27), pero tuvieron una reactividad
mayor en las PCP a la YH y la CH sin tratar que los niños en la clase HB‐2 (Figura
S1B).
3.4
| Reactividad de la IgE específica a fracciones de huevo y proteínas
La sensibilización
a fracciones de huevo y antígenos se probó mediante ImmunoCAP (n = 47 a CH y YH)
y ELISA (n = 44) y dio lugar a dos y
cuatro clases, de forma respectiva. Todos los niños que se evaluaron para la
sensibilización a la YH por ImmunoCAP
resultaron positivos excepto uno, y de manera significativa, menos sensibilizados
a la YH que a la CH (Figura 3A a la izquierda; p < 0.001). Las sensibilizaciones comparadas por paciente (Figura
derecha 3A) mostraron dos tendencias que definieron dos clases. Para 25 de 46
muestras, la pendiente (relación CH/YH) ascendió a 3.2 ± 0.2 (intervalo de
confianza de 95%: 2.9‐3.5), mientras que resultó alrededor del doble (7.3 ±
0.5, intervalo de confianza de 95%: 6.2‐8.3) para los otros 21.
La ELISA (Figura
3B) reveló que, de 44 niños, 41 estuvieron sensibilizados a la fracción CH 38 a
Gal d 1, 43 a Gal d 2, 32 a Gal d 3 y 26 a proteína de unión a riboflavina
(RBP). La IgE de 15, 21, 15, 6 niños se unió a lisozima (Gal d 4), ovoalbúmina‐X,
avidina y ovomucina, de manera respectiva. La fracción YH estuvo unida a la IgE
en 25 sueros, y la fracción plasmática YH estuvo involucrada en especial con
las livetinas y las subfracciones LDL unidas a la IgE en 15 y 16 sueros, de
forma respectiva. Las HDL y las fosvitinas de los gránulos se unieron por la
IgE en 8 y 2 sueros, de forma respectiva, con respuestas bajas. El análisis de
los datos de enlace de la IgE por clasificación jerárquica ascendente reveló
cuatro patrones de sensibilización (Figura 3C). La mitad de los niños (IgE-1; n = 22) mostró una gran unión de la IgE
a la CH, ovoalbúmina, ovomucoide y ovotransferrina y unión media de la IgE a la
RBP y la YH. El segundo patrón más frecuente (IgE ‐ 2; n = 15; 34%), se relacionó con la unión baja a media de la IgE a la
CH, la ovoalbúmina y la ovomucoide. Los otros dos patrones diferían en gran
medida. Uno se relacionó con la unión baja de la IgE a la CH con unión específica
a la lisozima (IgE-3; n = 4; 9%); el
otro a una unión media de la IgE a la CH con una mayor unión de la IgE a la ovotransferrina
que a la ovoalbúmina u ovomucoide y una baja unión de la IgE a la YH con una
gran unión de la IgE a la subfracción de la livetina (IgE-4; n = 3; 7%). Los niños en estas cuatro
clases de IgE no difirieron de manera particular ni por edad (p = 0.98), ni por la reactividad a las
fracciones en bruto en la PCP (p =
0.67, 0.18 y 0.34 para H, YH y CH, de forma respectiva).
3.5
| Análisis de los vínculos entre clasificaciones de los pacientes
Los pacientes se
clasificaron en tres grupos de edad (18‐30 meses, 30‐54 meses, 54‐84 meses; n = 17, 18 y 19, de manera respectiva) y
dos clases según la alergia asociada a otros alimentos, la alergia respiratoria
y a los que se le permitió el huevo al horno en la dieta por los médicos. Las
tablas de contingencia se analizaron mediante pruebas de x2, cuyos valores de p
se reportan en la tabla 1. Se encontró que las clasificaciones basadas en
respuestas relativas fueron independientes de la edad y la existencia de otras
alergias alimentarias o respiratorias. Además de los vínculos conocidos entre
la edad y las alergias alimentarias relacionadas y la alergia respiratoria, se
encontraron mejores vínculos entre la sensibilización IgE relativa (relación CH/YH
o al patrón de unión de IgE), la variación de la reactividad en las PCP con el
huevo hervido duro, y el consumo de huevo horneado permitido por los médicos.
Los niños que perdieron la reactividad en las PCP al hervir el huevo se mostraron
en particular menos sensibilizados a las fracciones CH y YH y a la RBP junto a
los alérgenos conocidos Gal d 1, Gal d 2 y Gal d 3 que los niños que mantuvieron
cierta reactividad (Figura 4A). La mayoría de los niños (20/21) con una
relación alta CH/YH mantuvieron cierta reactividad a las fracciones del huevo
duro, lo que resulta en descensos menores de forma significativa de la
reactividad de las PCP al H y a la CH en condiciones de ebullición según la
proporción (Figura 4B). Al final, los niños a los que se les permitió comer
huevo horneado tuvieron su PCP-reactividad al H y a la CH más reducida, en
especial, con el huevo duro hervido y una relación CH/YH más baja que los niños
con exclusión estricta (Figura 4C).
DISCUSIÓN
Al usar las PCP y
la IgE, se evidenciaron varios patrones de reactividad relativa a las
fracciones de los huevos o antígenos entre los niños alérgicos a los huevos. De
manera independiente a la edad y el nivel de sensibilización, las PCP se anularon
con el huevo hervido duro, la relación CH/YH y el perfil de la IgE determinaron
de forma estadística que los niños podían comer huevos horneados. Todos estos
niños presentaron una relación CH/YH baja (por debajo del valor de la mediana,
4.3), y la mayoría de ellos no tenía reactividad en las PCP a las tres fracciones
del huevo duro hervido. En línea con las PCP con muffin recién cocinado ya
propuestas, estos marcadores tienen la ventaja de usar pruebas realizadas en la
actualidad por alergólogos con una fracción compleja del huevo que reúne todos
los alérgenos.
Este estudio
señaló además el requisito de tener en cuenta tanto la CH como la YH. Todos los
niños que se evaluaron a la YH, a excepción de uno, estaban sensibilizados a la
CH y la YH, 25 de los 44 mostraron un enlace de IgE a YH por ELISA, y más de
70% tuvo las PCP positivas a YH cruda. Si la reactividad a la YH en crudo es,
como se asumió en general, más baja que a la CH en bruto para la mayoría de los
niños, resultó mayor para 6 niños. No son mayores que los niños sin reactividad
a la YH como se sugirió antes. La sensibilización a la YH involucró en especial
la fracción YH plasmática (LDL o fracciones de livetinas) que se asoció con
mayores sensibilizaciones a proteínas CH de acuerdo con estudios previos.
En la práctica
actual, las PCP con YH y CH sin procesar podrían permitir, de forma individual,
identificar el patrón de reactividad del paciente hacia las fracciones del
huevo. Sin embargo, se debe tener cuidado en relación con el riesgo potencial
de infección que podría evitarse al utilizar fracciones pasteurizadas o
extractos, siempre que no estén contaminados de forma cruzada y se estandaricen
de forma correcta. No se confirmó impacto de la pasteurización en la
alergenicidad del huevo, como se asumió en general, en el H y la CH para la
mayoría, pero no para todos los niños que se evaluaron. Esto puede relacionarse
con el despliegue y/o agregación de proteínas, que se produce durante la pasteurización.
Las clasificaciones de los niños según las variaciones de la reactividad con la
pasteurización y la ebullición difieren en las PCP. Las variaciones
individuales dependen de las proteínas a las que estuvieron sensibilizados y si
estas proteínas se modificaron en cada tratamiento térmico.
De acuerdo con los
estudios que reportaron una mayor sensibilización IgE a la CH y Gal d 1 o Gal d
2 en pacientes alérgicos a huevos cocidos, la sensibilización IgE difirió de
manera significativa entre las clases HB para la CH, Gal d 1, Gal d 2 pero
también para YH, Gal d 3, y RBP, lo que muestra que otras proteínas de la CH y la
YH pueden estar involucradas. Se evidenciaron cuatro patrones de
sensibilización, pero deberían establecerse en una cohorte más grande, en
particular los dos patrones menos frecuentes, para estudiar mejor su ocurrencia
y la relación con el efecto de los tratamientos térmicos o la tolerancia de los
huevos horneados.
Este estudio
señaló que las PCP se anulan con el huevo duro hervido o una relación CH/YH
baja como posibles marcadores para la tolerancia al huevo horneado. Se requiere
un estudio adicional observado por médicos, en una cohorte más grande con
pruebas a huevo y de forma sistemática para establecer el fenotipo tras la inclusión
y durante el control de los pacientes para establecer su relevancia clínica.
En conclusión,
este estudio destaca la heterogeneidad de las variaciones de las respuestas
individuales de las PCP e IgE entre los niños con alergia al huevo y que la
mayoría de ellos estuvieron sensibilizados tanto a la YH como a la CH.
Cualquiera que sea el nivel de sensibilización, las PCP individuales se
anularon con huevo duro hervido o una relación CH/YH baja, que aparecen como nuevos
marcadores para la tolerancia al huevo horneado, pero deben evaluarse más a
fondo.
ORIGINAL ARTICLE
Relative reactivity to egg white and yolk or change upon heating as markers for baked egg tolerance
Chantal Brossard Fabienne Rancé Martine Drouet Evelyne Paty Agnes Juchet Catherine Guérin‐Dubiard Maryvonne Pasco Olivier Tranquet Françoise Nau Sandra Denery‐Papini
Centro Regional de
Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital
Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México
Dra. Med. Sandra
Nora González Díaz Jefe y Profesor
Dra. med. Gabriela
Galindo Rodríguez Profesor
Dra. Natalhie
Acuña Ortega Residente 1er Año
Dra. Alejandra
Macías Weinmann Profesor
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