Alérgenos de la leche de bovinos: Una revisión exhaustiva

Introducción

El uso de leche de animales mamíferos domesticados en la dieta humana tiene una tradición muy larga. Hoy, el ganado vacuno, los búfalos, las ovejas, las cabras y los camellos se utilizan en diversas partes del mundo para la producción de leche y productos lácteos para el consumo humano. De acuerdo con esto, alrededor de 82.4% y 13.6% de la fuente de leche fresca a nivel mundial proviene de vacas y búfalos, de manera respectiva, mientras que el restante 4.0% se produce por cabras, ovejas y camellos. En las últimas 3 décadas, la producción mundial de leche creció más de 63%, se incrementó de 500 millones de toneladas en 1983 a 819.3 millones de toneladas en 2016. Asia contribuyó con casi 41% de la producción mundial de leche en 2016, con India como líder productor (19.6%).

Los continentes americano y europeo aseguran juntos casi 50% de la producción mundial de leche, donde Estados Unidos (11.8%) y Alemania (4.1%) ocupan los primeros puestos, de manera respectiva. En términos del comercio total de leche (participación de la producción), sólo 8.7% se destina a la importación/exportación. El consumo per cápita de leche es bastante alto (>150 kg/persona/año) en la mayoría de los países desarrollados (como los EE. UU., Finlandia, los Países Bajos, Reino Unido y Suecia), mientras que en los países en vías de desarrollo (como Angola, Haití, Guinea, Mozambique, Malawi y Liberia), la ingesta de leche y productos lácteos a menudo es menor de 30 kg/percápita/año. El consumo promedio de leche y productos lácteos en Europa es más de 218 kg/percápita/año, que corresponde de 8% a 9% de la energía dietética, 19% de la proteína dietética y de 11% a 14% de la ingesta de grasas en la dieta.

La leche es uno de los primeros alimentos que se debe introducir en una dieta del bebé como fuente de vitaminas y minerales (calcio, vitamina A y vitamina B6), al ser necesaria para el crecimiento y el desarrollo de niños pequeños, y benéfica para los huesos, el cabello, la piel y los dientes. Sin embargo, también es una de las primeras y más comunes causas de alergia alimentaria en la primera infancia. La alergia alimentaria se define como una reacción adversa mediada por el sistema inmune y causada por la ingesta de algún tipo de alimento que ocurre de manera reproducible en individuos alérgicos. Casi 90% de las alergias alimentarias reportadas a nivel mundial son causadas por 8 grupos de productos alimenticios, entre los cuales se incluye la leche. La alergia a la leche es mediada de forma típica por la inmunoglobulina E (IgE), que induce reacciones adversas a las proteínas presentes en la leche que pueden ocurrir después de su ingestión por individuos sensibilizados/alérgicos. Diferentes productos alimenticios pueden ser responsables de este tipo de alergia ya que las proteínas lácteas se utilizan como auxiliares de procesamiento, con la posibilidad de estar presentes en cantidades pequeñas en una gran cantidad de productos alimenticios. Además, las fórmulas infantiles, la leche en polvo, los quesos y los yogures se encuentran entre los productos alimenticios que utilizan a la leche como un ingrediente para su producción. Otro hecho importante es que la leche de todas las especies de rumiantes (tales como la vaca, la oveja y la cabra) contiene proteínas homólogas, que comparten las mismas propiedades estructurales, funcionales y biológicas y, por lo tanto, contribuyen al fenómeno de reactividad cruzada en individuos alérgicos.

Algunas veces, la alergia a la leche se confunde con la intolerancia a la leche, que es mucho más común y produce síntomas clínicos muy similares a los de la alergia a la leche, pero no es tan peligrosa. Al contrario que la alergia a la leche, la intolerancia a la leche es una reacción no inmunológica a un componente determinado de la leche, que causa trastornos en la digestión, la absorción o del metabolismo. Un ejemplo común es la malabsorción de la lactosa debida a una deficiencia intestinal de lactasa, que, por lo tanto, se clasifica como una enfermedad metabólica.

En la alergia verdadera a la leche, los síntomas típicos asociados con la IgE aparecen de inmediato o en las primeras 2 horas luego de la ingesta de leche. Puede afectar la piel (dermatitis atópica o eccema, angioedema o urticaria), el sistema respiratorio (rinitis, exacerbación del asma, sibilancias, infiltrados pulmonares o rinoconjuntivitis aguda) y el tracto gastrointestinal (vómitos, diarrea recurrente, dolor abdominal, cólico excesivo o reflujo gastroesofágico). En algunos casos, la reacción alérgica también puede involucrar 1 o más órganos o sistemas diana, lo que da lugar a una respuesta anafiláctica compleja y sistémica, que a menudo es mortal. Sin embargo, también pueden ocurrir manifestaciones inmunológicas adversas retardadas, por lo normal 2 horas después de la ingestión de la leche. En este caso, los mecanismos involucrados en general no son mediados por la IgE, que incluyen una gama amplia de presentaciones clínicas, como sangrado rectal escaso en la proctocolitis inducida por la proteína de leche o vómitos intensos en el síndrome de enterocolitis inducida por proteínas alimentarias. Por todo esto, los síntomas clínicos leves a moderados en individuos con alergia a la leche se atribuyen por lo común a un mecanismo no mediado por IgE, mientras que las respuestas inmunológicas adversas graves a menudo son mediadas por la IgE.

En la actualidad, no hay tratamiento para la alergia a la leche. Una vez diagnosticada, la prevención de una reacción alérgica se basa principalmente en la evitación total de los alimentos ofensores. Por lo tanto, para garantizar la protección del consumidor y garantizar la calidad de vida de las personas sensibilizadas, un sistema de etiquetado de alimentos correcto y veraz se convirtió en algo imperativo. Se establecieron y adoptaron medidas legales en la mayoría de los países del mundo para proteger la vida de estos individuos. En 1985, la Comisión del Codex Alimentarius emitió, por primera vez, una recomendación para el etiquetado obligatorio de alimentos preenvasados susceptibles de contener ingredientes alergénicos potenciales. De acuerdo con esta recomendación, 8 alimentos alergénicos (leche, frutos secos, cacahuates, cereales que contienen gluten, soya, pescado, huevos y crustáceos) y los sulfitos se propusieron como prioridad para los sistemas de etiquetado. Dentro de la Unión Europea (UE), la Directiva 2003/89/EC añadió al sésamo, el apio y la mostaza a los artículos anteriores, por lo tanto, se totalizan 12 grupos de productos. Desde entonces, la UE estableció una legislación que amplía la lista de prioridades a 14 grupos (con la adición de moluscos y lupino) que deben destacarse del resto de los ingredientes enumerados en los alimentos procesados, de manera independiente de su cantidad.

Sin embargo, la erradicación total del consumo de leche puede causar una deficiencia nutricional e influir en el crecimiento de bebés y niños. Como un intento de superar este problema, se investigó de manera amplia el desarrollo y la optimización de nuevas estrategias de procesamiento de la leche para destruir o modificar la estructura de estos alérgenos y por lo tanto, reducir o eliminar su alergenicidad.

Esta revisión pretende proporcionar una visión general sobre la prevalencia de alergia a la leche, su diagnóstico, y tratamiento, con énfasis en la caracterización de los alérgenos de la leche y los fenómenos de reactividad cruzada entre las leches de diferentes especies en los pacientes alérgicos. De manera adicional, se describen los métodos disponibles para la detección de alérgenos de la leche en los alimentos que contienen leche y proteínas de la leche y el efecto del procesamiento en la reducción de su alergenicidad.

Prevalencia, diagnóstico y tratamiento

Se reportó que en la actualidad de 0.6% a 3% de los niños menores de 6 años, 0.3% de los niños mayores y adolescentes y menos de 0.5% de adultos sufren de alergia a la leche de vaca, el tipo más común de alergia a la leche. De manera interesante, la mayoría de los bebés alérgicos a la leche superan su alergia y pueden consumir leche y sus productos, pese a que 15% de los niños afectados continúan siendo alérgicos a lo largo de la edad adulta. Un estudio reportó que de 45% a 50% de los niños superan la alergia a la leche a la edad de 1 año, de 60% a 75% a la edad de 2 años y de 85% a 90% a los 3 años, pero los mecanismos que subyacen al desarrollo de esta tolerancia natural aún no se entienden por completo.. El desarrollo de la tolerancia natural parece atribuirse a la disminución de la IgE debido a la erradicación de la ingesta de leche en las primeras etapas de la vida o a la presencia de IgE contra epítopos conformacionales principalmente (lo que permite el consumo de leche y productos lácteos), más que contra epítopos secuenciales.

El diagnóstico de alergia a la leche mediada por IgE se describe en detalle en un artículo reciente de la Organización Mundial de Alergia (WAO). El diagnóstico comienza con la observación de las manifestaciones clínicas y la historia médica, seguido por pruebas de diagnóstico in vitro e in vivo y pruebas de provocación oral (reto oral alimentario [OFC] y de una prueba de reto alimentario doble ciego controlada con placebo [DBPCFC]). Las pruebas de diagnóstico in vitro incluyen la determinación de IgE específica para alérgenos de leche en suero sanguíneo (ImmunoCAP, Phadia AB, Uppsala, Suecia). Las pruebas cutáneas por punción (SPT) se aplican in vivo con una fracción comercial de leche o fracciones de proteína de leche que se pinchan en la epidermis del paciente, lo que resulta en la aparición de una roncha más grande que el control si el paciente tiene IgE contra los alérgenos de la leche. Las pruebas de provocación oral, tales como el DBPCFC o el OFC se consideran métodos que son “estándares de oro” para el diagnóstico correcto de las alergias alimentarias. Consisten en la administración oral en días diferentes, de placebo y de un aumento progresivo de cantidades de leche hasta la aparición de síntomas clínicos observables (resultado positivo) o de síntomas clínicos subjetivos en la segunda administración de la misma cantidad del alimento ofensor. Si la prueba de provocación oral se considera negativa (ausencia de síntomas clínicos), se aconseja al paciente que reintroduzca de forma gradual la leche en la dieta diaria de acuerdo con un esquema específico.

El tratamiento efectivo actual para la alergia a la leche es la adopción de una dieta de eliminación. Sin embargo, la exposición accidental a las proteínas de la leche es recurrente, principalmente porque estos alérgenos están presentes en una gran cantidad de alimentos procesados, como productos cárnicos, productos de pescado, postres y productos de panadería, entre otros. En este caso, el tratamiento médico incluye a los antihistamínicos orales para las reacciones cutáneas o digestivas leves y el uso de epinefrina por autoinyector para reacciones sistémicas o respiratorias. De manera más reciente, se desarrollaron y aplicaron algunas estrategias para inducir la desensibilización o incluso la tolerancia, a diferentes alérgenos. La inmunoterapia muestra un avance como abordaje prometedor de tratamiento, con el objetivo de lograr un estado permanente de tolerancia en personas sensibilizadas. De acuerdo con las diferentes vías de administración (subcutánea, epicutánea, sublingual y oral), el paciente se expone a un aumento diario de dosis de los alimentos ofensores, para inducir la inmunomodulación y un estado de desensibilización. Estudios recientes con inmunoterapia la propusieron para la alergia a la leche con resultados prometedores. La inmunoterapia oral (ITO) muestra una tasa de éxito que varía de 37% a 70%.

Caracterización molecular de los alérgenos de la leche

En los últimos años, el gran aumento de la identificación de alérgenos y el conocimiento sobre sus secuencias permitió el establecimiento de bases de datos que proporcionan datos moleculares, bioquímicos y clínicos de los alérgenos. La lista oficial de alérgenos emitida por la Organización Mundial de la Salud/Subcomité de Nomenclatura de Alérgenos de la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (OMS/IUIS) y las bases de datos ALLERGOME son 2 de las numerosas fuentes accesibles. Los alérgenos de la leche incluidos en la lista oficial (WHO/IUIS) se identificaron todos como pertenecientes a la leche bovina (Bos domesticus).

La leche de vaca contiene cerca de 3 g de proteína por cada 100 ml e incluye al menos 25 proteínas diferentes, todas las cuales pueden actuar como antígenos. Las proteínas de la leche de vaca se clasifican en 2 categorías principales que se pueden separar en función de su solubilidad en pH de 4.6 y 20°C. El grupo de proteínas que se precipitan son caseínas (α_S1-caseína, α_S2-caseína, β-caseína y κ-caseína) y el grupo que permanece soluble se conoce como suero o proteínas del suero (β-lactoglobulina [β-LG], α-lactoalbúmina [ALA], lactoferrina bovina, albúmina de suero bovino [BSA] y las inmunoglobulinas bovinas), que corresponden a 80% y 20%, de forma respectiva. Las caseínas, la β-LG y la ALA se consideran los alérgenos principales o mayores; sin embargo, se demostró que la lactoferrina (LF), la BSA e inmunoglobulinas (Ig), que están presentes en cantidades menores, son de gran importancia en la inducción de alergia a la leche. Un resumen de los alérgenos conocidos de la leche de vaca, sus funciones biológicas, y números de acceso se proporcionan en la Tabla 1.

Caseínas (Bos d 8)

Las caseínas son la principal fracción de la proteína de la leche de vaca, que asciende aproximadamente a 80% de las proteínas totales de la leche, con tamaños que varían entre 19 a 25.2 kDa. De acuerdo con la lista oficial de alérgenos de la OMS/IUIS, las caseínas se clasifican con la designación general de Bos d 8. Sin embargo, a pesar de este nombre común (Bos d 8), algunos componentes individuales de las caseínas recibieron diferentes nombres de identificación. Las caseínas se codifican por diferentes genes ubicados en el mismo cromosoma, y se subdividen en distintas familias.. Las más importantes son: la α_S1-(Bos d 9), la α_S2-(Bos d 10), la β-(Bos d 11), y la κ-(Bos d 12) caseína, que representan 40%, 12.5%, 35%, y 12.5% de la fracción de caseína en la leche, de manera respectiva. Estas proteínas pertenecen a una gran familia de fosfoproteínas secretoras de unión al calcio, que tienen una estructura terciaria libre, una estructura con gran hidratación con un grupo fosfato de unión fuerte con cationes polivalentes como el calcio, que causan neutralización de carga y precipitación de la α_S1-, α_S2- y de la β-caseína a >6 mM de Ca²⁺ y 30°C. Sin embargo, en el caso de la κ-caseína, al contener una pequeña concentración del grupo fosfato, el calcio tiene una unión débil y no se precipita por ellos. En la leche, donde el calcio está presente a concentraciones altas, este hecho conduce a la formación de estructuras cuaternarias, llamadas micelas de caseína, en suspensión en la fase acuosa del lactosuero del suero.. Estas estructuras se caracterizan por un núcleo central hidrofóbico (α_S1-, α_S2- y β-caseínas sensibles al calcio) y una capa hidrofílica periférica (κ-caseína, Figura 1). Las funciones biológicas de las micelas de caseína incluyen el transporte y la secreción de calcio y fosfato y la digestión y la absorción de nutrientes por su retención en el estómago. Las caseínas se consideran como poco inmunogénicas, ya que sus estructuras son flexibles y no compactas. Se degradan de manera extensa por diversas enzimas proteolíticas durante la digestión, y son susceptibles a todas las proteinasas y exopeptidasas, pero no se afectan por agentes desnaturalizantes como la urea o el calor. Sin una estructura terciaria, las caseínas tienen una hidrofobicidad alta en su superficie. Debido a la naturaleza diferente de sus residuos (hidrofóbico, polar y con carga), no presentan una distribución uniforme en toda su estructura molecular, y se organizan en parches hidrofóbicos o hidrofílicos. Por esa razón, son estructuras muy anfipáticas, lo cual les de alta actividad en su superficie y son insolubles en el agua. Todas las caseínas presentan polimorfismos genéticos que conducen a muchas variantes proteicas lo que contribuye a su alta heterogeneidad. Estas variantes se caracterizan por la sustitución puntual de aminoácidos (AA), mediante la eliminación de fragmentos de péptidos de tamaño variable o por modificaciones postraduccionales, como la glicosilación, la fosforilación o la hidrólisis parcial, lo cual puede afectar su potencial alergénico.

Bos d 9 (α_S1-caseína). La α_S1-caseína es una fosfoproteína monocatenaria de 199 AA, con un tamaño molecular de 23.6 kDa y se caracteriza por un contenido alto de residuos de prolina. Tiene una estructura desordenada en más o menos 70%, con una fracción pequeña de estructura secundaria, como la hélice-α y las láminas β, y tiene además una reducción de su estructura terciaria debido a la carencia de enlaces disulfuro. Tiene 2 regiones hidrofóbicas, que contienen un total de 17 residuos de prolina, separados por una región polar que contiene grupos fosfato. La α_S1-caseína posee 7 variantes genéticas, que caracterizan a las diferentes razas de ganado.

Según Natale y colaboradores, cerca de 50% de las muestras de suero de pacientes con alergia a la leche de vaca reaccionan con la α_S1-caseína. Sin embargo, la prevalencia de sensibilización a cada fracción de caseína no es consensual, ya que la capacidad de unión a la IgE puede reducirse de forma fácil hasta por una única sustitución de AA o aumentarse al desenmascararse algunos epítopos de reactividad alta que antes estaban ocultos. La identificación de los sitios de reconocimiento de la IgE (epítopos de unión a la IgE) en el antígeno es una forma importante para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Por lo tanto, se realizaron varios estudios para identificar las regiones de unión a la IgE de la α_S1-caseína en humanos. La falta de una estructura terciaria clara en las caseínas sugiere la presencia de epítopos que en su mayoría son lineales. El grupo de Nakajima-Adachi identificó una sola región inmunodominante de unión a la IgE en la porción C-terminal (residuos de 181 a 199), mientras que Spuergin y colaboradores identificaron 3 epítopos inmunodominantes de unión a la IgE que se localizan en las regiones hidrofóbicas, donde no son accesibles a los anticuerpos, a menos que la caseína se desnaturalice o degrade durante la digestión. Chatchatee identificó 6 regiones principales de unión a la IgE y sugirió que hay una diferencia en el reconocimiento de los epítopos entre los pacientes con alergia persistente o transitoria a la leche de vaca. La región ubicada entre los residuos 28 a 50 que reconoció Cerecedo también se identificó por los grupo de Spuergin, Chatchatee y Elsayed. El grupo de Cong identificó 4 regiones diferentes con el reconocimiento del residuo crítico para la unión a la IgE.

Bos d 10 (α_S2-caseína). La α_S2-Caseína se compone de 207 AA, con 1 enlace disulfuro por molécula y una masa molecular de 25..2 kDa. Presenta 4 variantes genéticas (A, B, C y D) con diferentes cantidades de grupos fosforilo (de 10 a 13), que contiene uno de ellos (variante A) 11 residuos de fosfoserina con una estructura que es más bien inestable a los cambios del pH. La variante D tiene diferentes características estructurales, correspondientes a la eliminación de un grupo con 3 residuos de fosfoserina, que podría afectar el potencial alergénico de esta proteína.

Según Natale y colaboradores, la prevalencia de sensibilización a la α_S2-caseína en pacientes con alergia a la leche de vaca es de 90%. Buse reconoció en la α_S2-caseína 6 epítopos secuenciales menores de unión a la IgE y 4 mayores (detectados en 77% de los pacientes) mientras que Cerecedo sólo identificó 7 regiones, una de ellas similar con el estudio anterior.

Bos d 11 (β-caseína).  La β-Caseína se compone de 209 AA y 5 grupos fosfato, con una masa molecular de 24 kDa. Posee 12 variantes genéticas principales con diferentes niveles de fosforilación. Su estructura molecular es muy similar a la de la α_S1-caseína con un dominio globular hidrofóbico en el extremo C-terminal, un dominio altamente solvatado y cargado en el extremo N-terminal, así como una distribución uniforme de su contenido de prolina sin presentar enlaces disulfuro. La secuencia del ácido peptídico que contiene un grupo de residuos de fosfoserina es homóloga entre las caseínas, en concreto entre la β-caseína (¹³VESLSSSEE²¹) y la α_S1-caseína (⁶²AESISSSEE⁷⁰).. En la variante A de la α_S2-caseína, el grupo homólogo de residuos de fosfoserina se repite de forma parcial dos veces en las posiciones de residuos 7 a 12 (VSSSEE) y 55 a 60 (GSSSEE). De manera adicional, la β-caseína posee una estructura secundaria reducida y sin interacciones terciarias rígidas, como en el caso de la α_S1-caseína, lo que sugiere que sus epítopos alergénicos importantes son lineales más que conformacionales.

La β-caseína puede escindirse por la plasmina de la leche (proteasa natural) y originar otra familia de caseínas (γ1, γ2 y γ3), aunque se consideran no alergénicas. En cuanto a la identificación de los epítopos de unión a la IgE de la β-caseína, Otani concluyó que hay al menos 6 sitios antigénicos en la molécula y que los epítopos son secuenciales. Chatchatee también identificó 6 epítopos mayores de unión a la IgE y 3 menores, pero los datos sobre esta proteína todavía son escasos.

Bos d 12 (κ-caseína). La κ-caseína tiene una masa molecular de 19 kDa y una secuencia primaria de 169 AA, con un extremo N-terminal hidrofóbico y un extremo C-terminal muy hidrofílico. Esta proteína promueve la repulsión estérica y electrostática entre las micelas, y evita así la agregación. También es la única caseína glicosilada que contiene galactosa, galactosamina y ácido siálico. Esta proteína se produce como un tri o un tetrasacárido unido a residuos de treonina en la región C-terminal, lo cual aumenta su capacidad hidrofílica. Según el grado de glicosilación, pueden coexistir en la leche múltiples isoformas de κ-caseína. Hay 11 variantes de la κ-caseína debido a las diferencias en el número de los oligosacáridos que están juntos. Dado que es muy resistente a la precipitación del calcio, contribuye a la estabilización de otras caseínas. Sin embargo, esta capacidad se pierde mediante la división producida por el cuajo en la porción Phe105-Met106, lo que deja una porción hidrofóbica, para-κ-caseína, y una porción no hidrófila llamada glicomacropéptido de la κ-caseína o también “macropéptido caseíno” (CMP). El CMP tiene 64 AA y es responsable de la reducción del ácido gástrico y la secreción sérica de gastrina, lo que aumenta la eficiencia de la digestión. También posee propiedades anticoagulantes, previene la aglomeración plaquetaria y produce la secreción de serotonina. El número de los sitios de O-glucosilación en el CMP puede variar de 0 a 7, por lo que tanto las isoformas glicosiladas como las no glucosiladas existen en la leche digerida. Según Boutrou, las formas glicosiladas del CMP están menos digeridas que las no glicosiladas, lo que sugiere que la primera podría ser responsable de la posible inmunorreactividad del CMP.

Se detectaron ocho epítopos mayores de unión a la IgE en la κ-caseína por Chatchatee y otros: 3 de los cuales se reconocen en 93% de las muestras de suero de los pacientes con alergia a la leche de vaca (⁹IRCEKDERFFSDKIAKYI²⁶, ²¹KIAKYIPIQYLLSRYPSYGLNYY⁴⁴ y⁴⁷KPVALINNQFLPYPYYAKPAAVR⁶⁸) y 6 epítopos en la mayoría de los pacientes con mayor edad. Cerecedo y otros identificaron 2 regiones como epítopos dominantes (¹⁶RFFSDKIAKYIPIQYVLSRY³⁵ y ³⁴RYPSYGLNYYQQKPVALINN⁵³). Por lo tanto, la región comprendida entre los residuos en las posiciones 9 a 68 (en el extremo N-terminal) puede desempeñar un papel importante en la alergenicidad de esta proteína. Han reportó un total de 13 AA (en los puestos 17, 18, 29, 32, 35, 58, 61, 72, 97, 105, 118, 146 y 160) como residuos críticos para la unión de la IgE a los epítopos lineales de la kappa-caseína. La sustitución de los residuos nativos por otros resultó en pérdida/disminución general de la IgE unida en el conjunto de sueros y el suero individual del paciente para cada epítopo.

Proteínas del suero de la leche

Las proteínas del suero de la leche representan 20% de las proteínas de la leche de vaca. Los principales componentes alergénicos son las proteínas globulares Bos d 5 (β-LG) y Bos d 4 (ALA), que representan 50% y 25% de la fracción proteica del suero, de manera respectiva, seguidas de componentes menores, como Bos d 6 (BSA), Bos d 7 (inmunoglobulinas) y la lactoferrina. Al contrario que con las caseínas, las proteínas de suero de leche poseen niveles altos de estructuras secundarias, terciarias, y, en el caso de la β-LG de estructuras cuaternarias. Estas proteínas no están fosforiladas y contienen uniones intramoleculares disulfuro, que estabilizan su estructura.. La estructura tridimensional (3D) parece desempeñar un papel importante en el mantenimiento de los epítopos conformacionales, por lo tanto, contribuyen con el potencial alergénico de la proteína.

Bos d 4 (ALA).Bos d 4 es una metaloproteína monomérica globular de unión al calcio que pertenece a la familia de la glicosilhidrolasa (superfamilia de la lisozima C) y se identificó como alérgeno mayor de la leche de vaca. Su estructura primaria se constituye de 123 AA, con una masa molecular de 142 kDa y se reporta que tiene 3 variantes genéticas. Esta proteína es un componente regulador del sistema enzimático de la β-galactosil transferasa, responsable de la síntesis de lactosa mediante la formación del complejo lactosa sintetasa. También se sabe que interactúa con las membranas lipídicas (ácidos esteárico y palmítico) y se une con metales tales como el cobalto, el magnesio y el zinc. Posee 4 puentes disulfuro y un sitio de unión de alta afinidad para el calcio, que estabiliza su estructura secundaria. Además, la ALA muestra estabilidad térmica alta y capacidad de replegado. Tiene una estructura secundaria muy ordenada y una estructura terciaria compacta y esférica, tiene un “lazo de unión al Ca²⁺ de tipo codo” con 2 dominios estructurales: un gran dominio α-helicoidal en el sitio N-terminal y un dominio corto tipo lámina-β en el extremo C-terminal, que flanquea el lazo de unión al calcio. De acuerdo con la población de estudio, la prevalencia de IgE específica para ALA en los pacientes con alergia a la leche oscila entre 27.6% y 62.8%. El péptido ⁵KCEVFRELKDLKGY¹⁸, que corresponde a una secuencia homóloga de la β-LG (Bos d 5) en las posiciones 124 a 135, se considera como un sitio antigénico principal, con una gran capacidad para unirse con la IgE específica sérica humana. Maynard demostró la unión de la IgE con la ALA natural y con péptidos grandes, lo que sugiere la importancia de los epítopos conformacionales en el desarrollo de la alergia a la leche. Sin embargo, también mostró que la desnaturalización de las proteínas podría exponer algunos epítopos lineales. Hochwallner y colaboradores identificaron 6 péptidos reactivos a la IgE, tres de los cuales se localizan en la superficie de la proteína y uno de ellos corresponde al sitio antigénico principal arriba mencionado. Jarvinen identificó la misma región y a 3 epítopos conformacionales adicionales para la IgE. Hopp y Woods reconocieron otra región con alta antigenicidad que representa de 20% a 25% de la antigenicidad total de la ALA en el péptido que incluye el bucle ⁶⁰WCKNDQDPHSSNICNISCDKF⁸⁰. De forma más reciente, Li y colaboradores identificaron 6 epítopos lineales de unión a la IgE, que corresponden con aquellos encontrados en los estudios previos de Maynard y Jarvinen.

Bos d 5 (β-LG).La Bos d 5 es una proteína de unión al retinol que pertenece a la superfamilia de la lipocalina, y se clasifica como un alérgeno mayor de la leche. Se une a una amplia variedad de moléculas como el colesterol y la vitamina D2, los ácidos grasos saturados e insaturados, los iones Cu²⁺ y Fe²⁺, ligandos hidrofóbicos como el retinol y posee también una actividad antioxidante. Es un dímero de 36 kDa con 2 isoformas principales que difieren sólo en mutaciones de 2 puntos en los residuos 64 y 118. Cada subunidad consiste en 162 AA que poseen una cisteína libre y dos enlaces disulfuro que son responsables de la dimerización de la molécula. Esta proteína tiene una estructura terciaria bien caracterizada que es común a la superfamilia de la lipocalina, con una forma globular formada por 8 hebras antiparalelas, que forman una estructura tipo β-barril con una α-hélice de 3 vueltas en la superficie externa y una novena cadena β que flanquea a la primera cadena. Esta estructura es responsable de sus principales propiedades fisicoquímicas y por sus interacciones sulfidrildisulfuro con la κ-caseína cuando se expone a procesos con calor con temperaturas superiores a 75°C, tiene una resistencia relativa a la hidrólisis ácida, así como a la actividad de las proteasas. Estas características permiten preservar cierta integridad estructural luego de la digestión, y permiten su absorción a través de la mucosa intestinal con la subsecuente presentación a las células inmunocompetentes, y, por tanto, tiene un potencial alergénico alto. Las alergias alimentarias asociadas con esta proteína se estiman en 80% de la población. Por esta razón, se realizaron varios estudios que se centran en la identificación de las regiones de unión a la IgE. Muchos autores describieron al péptido ¹²¹CLVRTPEVDDEAL¹³⁴, ubicado en la superficie de la proteína, como un sitio alergénico mayor.  El grupo de Jarvinen identificó 7 epítopos de unión a la IgE, pero sólo 3 se consideraron inmunodominantes, uno de los cuales correspondía a la misma región (residuos 121 a 134). Además, afirmaron que la presencia de IgE en múltiples epítopos alergénicos podría ser un indicador de alergia persistente. Este hecho también se evidenció por Picariello, ya que indicó que la misma región (residuos 125 a 135) tenía el potencial alergénico más importante entre los determinantes de la β-LG debido a su alta resistencia a la proteólisis. Cerecedo identificó 3 epítopos que se reconocieron por más de 75% de los sueros de pacientes alérgicos con la región ⁵⁸LQKWENDECAQKKIIAEKTK⁷⁷, que se asocian de manera significativa con los pacientes reactivos a las proteínas de la leche. El grupo de Con determinó 4 epítopos de unión a la IgE, a saber: ¹⁷LIVTQTMKGLDIQKV³¹,⁷²ILLQKWENGECAQKK⁸⁶, ⁹²TKIPAVFKIDALNEN¹⁰⁶, y ¹⁵²FDKALKALPMHIRLS¹⁶⁶ y 2 epítopos de unión a la IgG (²²TMKGLDIQKVAGTWY³⁶ y ¹²⁷AEPEQSLACQCLVRT¹⁴¹). De acuerdo con esto, los autores identificaron diferentes residuos críticos para la unión de la IgE y la IgG, ubicados en los epítopos ¹⁷LIVTQTMKGLDIQKV³¹ (Thr20, Met23 y Asp27) y ²²TMKGLDIQKVAGTWY³⁶ (Leu26 y Val31), de manera respectiva. Tanto Ball, como Heinzmann y Selo también identificaron algunos epítopos lineales menores y mayores, algunos de ellos no estaban expuestos en la superficie de la molécula y, por lo tanto, estaban bien protegidos contra el ataque de diversas enzimas, lo que sugiere una relativa menor importancia en términos de inmunorreactividad.

El reconocimiento de proteínas y péptidos específicos que se comportan como alérgenos potentes se puede considerar como un adelanto para el diagnóstico de resolución por componentes y como una herramienta de diagnóstico nueva y muy eficiente (técnica de análisis en micromatrices). Estas micromatrices pueden determinar diferentes patrones de unión a epítopos, lo que permitiría diferenciar los fenotipos clínicos de la alergia a la leche. En última instancia, Bos d 5 se considera un alérgeno mayor con múltiples epítopos lineales de unión a la IgE, lo que destaca la importancia de sus péptidos específicos como marcadores moleculares para el diagnóstico de alergia persistente a la leche.

Bos d 6 (BSA).Bos d 6, aunque está presente en la leche sólo en cantidades bajas, reacciona con la IgE de 50% de los pacientes alérgicos a la leche, lo que hace que se clasifique como un alérgeno mayor. Tiene 582 AA y un peso molecular de 66.3 kDa, con una estructura terciaria estable. Su papel biológico principal se relaciona con el transporte, el metabolismo y la distribución de varias sustancias (ácidos grasos, iones, hormonas y drogas) y la protección contra los radicales libres. Contribuye a la regulación de la presión osmótica coloidal de la sangre que produce protección contra los radicales libres. Esta proteína se organiza en 3 dominios homólogos y consta de 9 bucles conectados por 17 enlaces disulfuro, muchos de los cuales están protegidos dentro del núcleo de la proteína, y son, por lo tanto, de difícil acceso. Los enlaces disulfuro desempeñan un papel importante en el mantenimiento de los determinantes antigénicos naturales de esta molécula, principalmente debido a la gran estabilidad de su estructura terciaria, incluso en condiciones de desnaturalización. Se demostró que el fragmento que comprende a los residuos en las posiciones de la 524 a la 598, es un área epitópica para la especie humana, de la cual las regiones ⁵²⁴AFDEKLFTFHADICTLPDT⁵⁴² corresponden a la secuencia más crítica. Tanabe también identificó algunos epítopos de BSA involucrados en la alergia a la carne. Sin embargo, los epítopos reportados en diversos estudios no fueron siempre los mismos.

Bos d 7 (Ig).Bos d 7 representa 3% de la proteína total de la leche aproximadamente y 6% de las proteínas del suero de la leche. Posee una estructura conformacional muy similar a la humana, que se desarrolla en forma de polímeros o protómeros de una unidad básica en forma de “Y” que está compuesta de 4 cadenas de polipéptidos unidas por enlaces disulfuro inter e intramoleculares. Los monómeros se componen de cadenas pesadas (H) y ligeras (L), cada una de las cuales posee dominios variables (V-) y constantes (C-). Los dominios variables de las cadenas H y L convergen para formar el sitio de unión al antígeno, mientras que los dominios C caracterizan a los isotipos de la Ig en la leche de vaca: IgG, IgA o IgM. La alergenicidad potencial de la Ig bovina todavía está en estudio y sus epítopos de unión a la IgE aún no se identifican. Sin embargo, se propuso a la IgG como alérgeno lácteo al observarse que la IgE de los pacientes alérgicos a la leche se une de manera específica con la IgG bovina. Aproximadamente, casi 10% de los pacientes con alergia a la leche de vaca son IgE positivos para la IgG vacuna, por lo tanto, esta proteína se considera como un alérgeno menor en la leche.

Lactoferrina. La lactoferrina (LF) es una glicoproteína de unión al hierro que pertenece a la familia de la transferrina y se encuentra en niveles menores a 1% en la leche de la mayoría de las especies. Consiste en una sola cadena polipeptídica plegada en 2 lóbulos globulares, cada uno de los cuales tiene una afinidad alta a los sitios de unión al hierro, que se conectan por una hélice de 3 vueltas. El peso molecular de esta proteína varía según el grado de extensión de su glicosilación. Además de su función antioxidante y de eliminación de radicales libres, su papel principal es defender al organismo contra las infecciones y la inflamación gracias a su capacidad de secuestrar hierro del medio ambiente y, por lo tanto, eliminar este nutriente que es esencial para el crecimiento bacteriano. Además, se involucra en diferentes procesos de desintoxicación y tiene un efecto antineoplásico logrado mediante la inhibición de la unión de los factores de crecimiento tumoral. Algunos estudios declaran que algunas personas con alergia a la leche poseen una IgE específica para la lactoferrina, aunque la relevancia de la alergenicidad de esta proteína todavía está bajo discusión debido a que estos pacientes también presentan una IgE contra alguno de los alérgenos mayores de la leche. Hasta el presente, no hay datos reportados sobre la identificación de epítopos de unión a la IgE.

Reactividad cruzada de los alérgenos de la leche

Aunque las proteínas de la leche reconocidas de forma oficial como alérgenos alimentarios son de origen bovino, hay muchos otros animales lecheros cuya leche se utiliza para el consumo humano y, por lo tanto, pueden iniciar una reacción alérgica en individuos susceptibles mediante la ingestión de proteínas homólogas. La leche y las proteínas de la leche de búfalos, ovejas, cabras, cerdos, camellos, yeguas, burros, renos y de yak se puede usar para producir productos lácteos o se pueden agregar a la leche de vaca. Por lo tanto, las proteínas de leche homólogas de diferentes especies pueden conducir a fenómenos de reactividad cruzada en individuos sensibilizados o alérgicos.

Diferentes estudios revelan que la gran mayoría de los pacientes con alergia a la leche de vaca tienen una reactividad cruzada alta con la leche de ovejas, búfalos y cabra, lo que podría explicarse por la gran similitud en la composición de sus proteínas, aunque presenten una distribución diferente. Por el contrario, muy pocos individuos alérgicos a la leche de vaca presentan reactividad cruzada con el burro, la yegua y la leche de camello, cuyas estructuras son más similares a la leche humana. La leche de yegua presenta una reducción en la fracción de caseína, mientras que la leche de camello muestra una proporción alta de β-caseína y carece de β-LG lo cual es parecido a la leche humana. Restani y otros hicieron pruebas con sueros de pacientes alérgicos a la leche de vaca y con proteínas lácteas de otras especies de mamíferos. Gracias a esto, los autores mostraron una fuerte reactividad IgE de los sueros con la mayoría de las proteínas lácteas de ovejas, cabras y búfalos, mientras que no se observó la unión a la IgE al analizar la leche de camello, lo que se podría explicar por las diferencias filogenéticas entre la vaca y el camello. Al usar anticuerpos monoclonales animales específicos para las proteínas de la leche de vaca, Restani confirmó los resultados anteriores, pero también observó una inmunorreactividad débil con la leche de yegua y de burra. Estos resultados también los obtuvo Katz al realizar SPT en pacientes con antecedentes clínicos consistentes con alergia a la proteína de la leche de vaca mediada por IgE. Los autores agregaron al venado como especie que produce reacción cruzada y al cerdo como al menos reactivo de todos, lo que sugiere la existencia de un “epítopo kosher” como responsable para esta alergenicidad común. Suutari demostró que la β-LG de la leche de reno tiene una reactividad cruzada débil con la β-LG bovina, pese a ser también una especie rumiante, lo cual es probable que se deba a la falta de epítopos homólogos bovinos en la proteína o a un enlace débil con aquellos que son reconocidos.

Dado que la leche de cabra contiene una menor cantidad de α-caseínas, se sugiriró como un sustituto de la leche de vaca para pacientes alérgicos, aunque los resultados sobre su reactividad cruzada persisten como controversiales. Algunos reportes sugieren que los niños alérgicos a la leche de vaca pueden tolerar la leche de cabra y oveja debido a la unión débil de la IgE a las caseínas. Sin embargo, la mayoría de los estudios demuestran una reactividad cruzada alta entre las proteínas de vaca y cabra. Por otro lado, hay individuos, en particular niños mayores, que presentan reacciones alérgicas que son relevantes e incluso graves a la leche de cabra y oveja, sin manifestación clínica hacia la leche de vaca. En esos casos, la IgE se une a las caseínas (α_S1-, α_S2- y β-caseínas) con alta especificidad y eficiencia, pero no a las proteínas del suero, a pesar de la pronunciada homología de sus secuencias. Varios estudios reportaron que los pacientes con alergia a la leche de vaca tienen reactividad cruzada con la leche de ovejas y cabras, pero no al revés. No obstante, la razón de este fenómeno aún no está clara.

Tanto la leche de burra como la de yegua se revelaron como menos alergénicas, con una reactividad cruzada muy débil con la IgE. Algunos autores sugieren el uso de leche de burra en niños con alergia grave a la leche de vaca, lo que confirma que 80% de los niños toleraron mejor la leche de burra que la leche de cabra y que es más eficaz para la mejoría de la dermatitis atópica.

Las proteínas de la caseína están presentes en la leche de diferentes especies de rumiantes con grandes homologías de secuencia, que varían desde 80% a más de 90%, y comparten las mismas propiedades estructurales, funcionales y biológicas. Por ejemplo, las caseínas α_S1, α_S2 y β-caseínas de vaca, cabra y ovejas comparten entre 87% a 98% de identidad de secuencia, con una sensibilización de la IgE a la caseína de oveja y cabra que va de 93% a 98% en niños con alergia a la leche de vaca. Por otra parte, se demostró que las β-caseínas humana y bovina también comparten aproximadamente 50% de homología de secuencia. Estas regiones corresponden a los grupos de residuos serilfosforilados que se conservan en las caseínas bovinas, así como en las caseínas de otras especies, lo que de manera probable desempeña un papel importante en la reactividad cruzada entre la leche de diferentes especies. Bernard y colaboradores demostraron que 99% del suero de los pacientes (n = 58) reaccionaron a más de una caseína y 88% presentó una IgE contra cada una de las 4 caseínas bovinas. Este descubrimiento sugiere la presencia de epítopos de IgE comunes o relacionados de forma estrecha, que es posible que se asocien con sitios de fosforilación, descritos como inmunorreactivos y resistentes a la degradación digestiva, o con una polisensibilización a diferentes componentes de la caseína después de la disrupción de las micelas de caseína durante el proceso digestivo. En otro estudio, Bernard mostró una reactividad cruzada entre las β-caseínas humanas y bovinas, aunque con menor afinidad de la IgE a las β-caseínas humanas. La similitud de las caseínas humana y bovina también se demostró en el estudio de Han, que muestra 2 sitios potenciales de reacción cruzada de epítopos de unión a la IgE entre la κ-caseína humana y bovina. Además, las secuencias de ALA bovina y humana comparten 74% de homología de secuencia. La distribución de proteínas en la leche humana es bastante diferente de la de la leche de los bovinos, pero es más similar a la leche de burra y yegua porque tienen un contenido menor en caseínas. Además, la β-LG está ausente en la leche humana, de manera contraria a otras leches de mamíferos. Aun así, la homología de secuencias entre la leche humana y la leche bovina es bastante alta, lo que lleva a reacciones alérgicas cruzadas en algunos pacientes.

Hasta ahora, la leche de camello parece ser el sustituto más adecuado de la leche de vaca, principalmente debido a la proporción alta de β-caseína, su proporción baja de α-caseína, no tener ALA y su similitud de Ig. La leche de camello muestra el nivel más bajo de similitud (alrededor de 60%) con las proteínas de la leche de vaca. Se realizaron muchos esfuerzos para estudiar la fiabilidad del uso de leche de camello en pacientes alérgicos con resultados interesantes y prometedores.

La reactividad cruzada en pacientes sensibilizados puede ocurrir, no sólo entre proteínas lácteas de diferentes especies, sino también con proteínas presentes en otros tejidos, como en la carne o el epitelio de diferentes mamíferos. La albúmina de leche bovina es muy similar a la albúmina sérica humana y al ser muy fácil de obtener, tiene numerosas aplicaciones en formulaciones médicas, tales como componente de varias vacunas. La mayor parte de las personas con alergia a la leche persistente son conocidas por ser reactivas a las albúminas séricas de diferentes carnes de mamíferos, lo que aumenta su riesgo de desarrollar síntomas clínicos tales como la rinoconjuntivitis o el asma, debido a los epitelios animales. Por lo tanto, la BSA es un ejemplo común del fenómeno de reactividad cruzada y se involucra en la cosensibilización a la leche y la carne vacuna con una prevalencia entre 13% y 20% entre los pacientes con alergia a la leche de vaca. Vicente-Serrano demostró que el suero de pacientes alérgicos a la leche de vaca con una IgE ligada a la BSA también reconoció la albúmina sérica natural de diferentes carnes (ternera, cordero, ciervo y cerdo) y diferentes epitelios (perro, gato y vaca). Sin embargo, ninguno de ellas reaccionó con carnes expuestas al calor, lo que sugiere la implicación de la desnaturalización térmica en la reducción de la alergenicidad de la albúmina sérica. Los autores también demostraron que las albúminas actúan como panalérgenos (alérgenos responsables de una reactividad cruzada amplia de la IgE entre diferentes fuentes alergénicas relacionadas y no relacionadas) en los mamíferos.

Las fórmulas de soya son sustitutos comunes de la leche en las personas alérgicas a la leche de vaca. Sin embargo, se demostró que algunos pacientes son intolerantes a tales productos, lo que sugiere la reactividad cruzada entre las proteínas de la leche de vaca y la soya. Se reportó que la subunidad α de la beta-conglicinina (Gly m 5.0101) propia de la familia de proteínas semejantes a la vicilina, como la subunidad G4 de la glicinina (Gly m 6.0401) perteneciente a las proteínas semejantes a la legumina y de manera más reciente, la cisteína proteasa P34 (Gly m Bd30K) y la globulina P28 (Gly m Bd28K), están involucradas en los fenómenos de reactividad cruzada con caseínas bovinas.

Debido a la gran alergenicidad de las proteínas lácteas de otras especies, las bases de datos como ALLERGOME incluyen algunas de estas proteínas en su lista (no oficial) de alérgenos. La Tabla 2 resume a los alérgenos implicados en la reactividad cruzada a las proteínas de la leche (tanto de manera oficial como no oficial), con los nombres respectivos de las bases de datos ALLERGOME y OMS/IUIS.

Efecto del procesamiento, la matriz de alimentos y la digestibilidad en la alergenicidad a la leche

Se puede manufacturar una gama amplia de productos alimenticios a partir de la leche como materia prima A escala mundial, se utiliza 36% de la leche de vaca para la producción de queso, 30% para los productos relacionados con la mantequilla, 13% para la fabricación de cremas de leche, 11% se consume como leche fluida bebible y 3% se usa para la fabricación de leche en polvo. Tanto la leche condensada, como la evaporada y la fermentada también se consumen, pero en cantidades más pequeñas; la caseína y las proteínas del suero se utilizan como ingredientes en varios productos, como quesos, productos de panadería y pegamentos. La leche de otras especies, como ovejas y cabras, también se utiliza de manera predominante para la fabricación de leches y quesos fermentados. Por lo tanto, la leche y las proteínas lácteas pueden estar presentes en varias matrices de alimentos y se someten a diferentes tipos de procesamiento, hasta que se convierten en un producto disponible para los consumidores como productos finales. Los procesos alimentarios aplicados a la leche y los productos lácteos pueden incluir la pasteurización o el tratamiento con ultraalta temperatura (UHT) para eliminar los patógenos de la leche fluida, la fermentación para la producción de yogurt, y la evaporación y la técnica de secado por pulverización para obtener concentrados y leche en polvo para fórmulas de lactantes, de manera respectiva.

El procesamiento de los alimentos puede inducir diferentes modificaciones en la estructura de las proteínas, que incluyen la agregación, el despliegue y la glicación, así como también que se formen productos derivados por medio de la reacción de Maillard. Todas estas alteraciones pueden afectar la capacidad de unión a la IgE y, en consecuencia, aumentar o reducir la alergenicidad de las proteínas. Es normal que dicha reducción se atribuya a la destrucción de diferentes epítopos conformacionales o a reacciones químicas entre proteínas, grasas y azúcares que ocurren en la matriz de los alimentos, lo que limita la disponibilidad para el sistema inmune de dicha proteína. Por otro lado, la formación de neoepítopos y el efecto sobre la matriz de los alimentos que disminuye la digestibilidad de las proteínas (y, en consecuencia, la preservación de los epítopos existentes) podrían aumentar de forma potencial la alergenicidad proteica. El contenido alto de proteínas en una matriz alimentaria parece mejorar la estabilidad contra la degradación gastrointestinal simulada y crear un entorno competitivo para la segmentación enzimática, lo que retrasaría la proteólisis gastrointestinal de los alérgenos alimentarios.

Se realizaron muchos esfuerzos para estudiar la influencia de diferentes tecnologías de procesamiento de la leche sobre la reducción de la alergenicidad, para encontrar procesos nuevos y eficaces para aplicar a los productos lácteos que lleven al control de la alergia a la leche. Las tablas 3 y 4 resumen varios estudios recientes sobre la modificación de los alérgenos de la leche y la alergenicidad sobre tecnologías convencionales y novedosas de procesamiento de alimentos.

Procesamiento convencional de alimentos

Tratamiento térmico. El tratamiento térmico es un paso importante en la fabricación de la mayoría de los productos lácteos mediante el uso de técnicas como la pasteurización, la esterilización y el procesamiento por UHT. Por naturaleza, las caseínas se consideran proteínas desordenadas de manera intrínseca, que poseen muy pocas estructuras secundarias y terciarias (como en el caso de la β- y κ-caseínas), pero todavía capaces de realizar su función. Por todo esto, son muy estables al tratamiento con calor, sin mostrar cambios o sólo una reducción parcial de su alergenicidad. Bloom demostró la presencia de caseínas después de 60 minutos a 95°C, sin que haya una diferencia sustancial en su inmunorreactividad. Aunque la alergenicidad de la caseína puede ser influenciada tanto por el período, la temperatura y la presencia de otros alimentos (por ejemplo, el trigo) durante el proceso de calentamiento, todas las muestras de suero tomadas de sujetos alérgicos a la leche permanecieron con IgE reactiva a las caseínas, incluso después de un tratamiento térmico extenso. Del mismo modo, Morisawa demostró que las α-caseínas sometidas a tratamiento térmico no afectan la cantidad de histamina liberada por los basófilos, pero que la combinación de tratamiento térmico junto con la digestión enzimática condujo a una disminución de la liberación de histamina, lo que confirma la relación de la IgE específica para la α-caseína con sus epítopos lineales.

Al contrario, las proteínas del suero de la leche son termolábiles, y muestran cambios en su alergenicidad. La β-LG muestra un aumento de su antigenicidad y de su alergenicidad cuando se somete a temperaturas que van desde 50° hasta 90°C debido a la exposición de epítopos alergénicos después del desdoblamiento de la estructura natural de la proteína. Por encima de 90°C, la alergenicidad de la β-LG parece disminuir debido al intercambio de sulfhidrilodisulfuro, que aumenta los cambios conformacionales con la subsecuente destrucción o enmascaramiento de algunos epítopos conformacionales de la superficie de la molécula. Además de la agregación mediada por disulfuro a esas temperaturas (90 a 120°C), las reacciones de Maillard podrían producir la pérdida de epítopos lineales lo que conduciría a una reducción general de la alergenicidad de la β-LG. La Figura 2 muestra una representación esquemática del efecto del tratamiento térmico a diferentes temperaturas en la estructura de la β-LG. La combinación del tratamiento térmico con la digestión con pepsina también mostró una reducción en la alergenicidad de la β-LG. La ALA es más estable al calor que la β-LG, pero a temperaturas altas presenta una mayor disminución de su antigenicidad porque se cree que sus epítopos conformacionales son más reactivos con la IgE, mientras que los epítopos más relevantes en la β-LG son lineales. Además, el calentamiento de la β-LG o de la ALA resulta en la formación de enlaces disulfuro intermoleculares y la subsecuente unión a otras proteínas alimentarias. Por lo tanto, estos mecanismos de agregación hacen que los epítopos de la IgE sean menos accesibles y, en consecuencia, menos alergénicos. Este efecto en la matriz llevó a algunos autores a sugerir una dieta con leche horneada, ya que en diversos estudios casi 70% de los niños estudiados pudieron ingerir un muffin que contenía leche horneada sin ningún síntoma clínico inmediato. Después de pruebas de reto alimentarias secuenciales con queso al horno y leche sin calentar en una población de niños tolerantes a los productos lácteos calentados a temperaturas altas (horneados), Kim reveló que 28% y 60% de ellos fueron capaces de tolerar la leche horneada/queso horneado y la leche sin calentar, de manera respectiva. Sopo evaluó el efecto de la matriz de trigo en la tolerancia a la leche horneada en niños con alergia a la leche de vaca mediada por IgE. Demostró que 81% de los niños toleraron la leche de vaca horneada en una matriz de trigo (ciambellone), 56% toleró la leche de vaca fluida horneada, 78% el queso parmesano Reggiano (un queso italiano típico) y 82% la fórmula parcialmente hidrolizada, lo que revela que el efecto de matriz era relevante sólo en la mitad de los casos. La tolerancia al parmesano Reggiano también se estudió por Alessandri en pacientes con sospecha de alergia a la leche de vaca, y reportó que 56% de los niños toleraron el queso italiano después de una maduración de 36 meses. Estos datos se correlacionaron con el grado de maduración del queso, en el que las proteínas de la leche, en especial las caseínas, se rompen de manera gradual y constante por las enzimas proteolíticas de las bacterias del ácido láctico y del cuajo de la leche, lo que resulta en una disminución de la alergenicidad durante la digestión intestinal.

Técnicas tales como la esterilización provocan la desnaturalización de 75% de las proteínas de suero de la leche y promueven las reacciones de Maillard, que ocurren entre grupos de AA y aldehído/cetonas libres de azúcar presentes en la leche o en otras matrices de alimentos y se sabe que cambian la estructura conformacional al afectar la alergenicidad de las proteínas. El efecto de conjugación de las proteínas alergénicas con azúcares reductores por medio de las reacciones de Maillard se estudió de forma amplia como una posible solución para reducir la alergenicidad a la leche. Incluso en proteínas con resistencia alta a la proteólisis, se reportó que hay un aumento en la digestibilidad in vitro y una reducción en su inmunorreactividad. Tanto la glucosa, el quitosano, la nistosa, la fructofuranosil nistosa, los fructooligosacáridos, la oligoisomaltosa, la maltosa, así como el carboximetil dextrano son algunos azúcares con efectos reportados en la reducción de la antigenicidad y la alergenicidad a la β-LG y a la ALA. Las reacciones de Maillard entre la lactosa (disacárido) y los grupos amino accesibles de los residuos de lisina en las proteínas del suero también podrían ocurrir, lo que llevaría a la formación de productos de Amadori. Como se reportó con otros azúcares, el aumento de la temperatura hasta 130°C durante 20 minutos conduce a la formación de productos de Maillard a partir de lactosa y las proteínas del suero de la leche (principalmente la ALA y la β-LG), con una disminución en la capacidad de unión a la IgG de al menos 67% en comparación con las muestras no sometidas al calor. Dado que la ALA y la β-LG presentan varios residuos de lisina localizados en las regiones de unión a la IgG, es probable que el bloqueo de los residuos de lisina durante la formación de productos de Maillard indujo alteraciones conformacionales en sus epítopos, lo que afecta a la capacidad de unión de la IgG con las proteínas del suero de la leche. Por otro lado, las proteínas que se someten a un proceso de lactosilación son más resistente a la proteólisis, lo que contribuiría a la formación de especies inmunorreactivas que aumentarían la alergenicidad de las proteínas del suero (ALA y β-LG), aunque el tratamiento térmico parece reducir su inmunorreactividad.

El enmascaramiento de los epítopos naturales/conformacionales es una posible explicación, pero también pueden emerger nuevos epítopos después de la conjugación con algunas sustancias, debido a la exposición de algunas regiones hidrofóbicas. Además, la presencia de condiciones tales como el pH, la temperatura, la duración de la exposición, la relación del peso de azúcar/proteína y las pruebas previas de digestión deben establecerse bien para inducir un efecto máximo sobre la antigenicidad y la alergenicidad.

Es lamentable que no haya reportes sobre los efectos de otros tratamientos de calor, tales como la UHT, la evaporación al vacío o el secado por pulverización, en relación con la alergenicidad, a pesar de que algunos estudios recientes describen su efecto sobre las propiedades funcionales de las proteínas de la leche.

Fermentación e hidrólisis enzimática. La fermentación por bacterias productoras de ácido láctico es un proceso utilizado de forma común para producir diferentes tipos de productos lácteos, como mantequillas de yogurt y nata madurada. Estas bacterias poseen un sistema proteolítico complejo que incluye peptidasas, proteinasas y sistemas de transporte, todos esenciales para su crecimiento en la leche y los productos lácteos. Durante la fermentación, estas enzimas hidrolizan las proteínas de la leche en péptidos y AA que aumentan en gran medida la posibilidad de escindir epítopos relevantes y, en consecuencia, disminuyen su antigenicidad y alergenicidad. Wróblewska reportó una reducción significativa en la inmunorreactividad de la ALA, la β-LG, la α-caseína, la β-caseína, la κ-caseína, la BSA y la LF después de la fermentación del suero de leche por Lactobacillus casei, que fue incluso mayor después de la digestión simulada. A pesar de la reducción de 21% de la inmunorreactividad a la α-caseína, esta proteína todavía era la más reactiva. Esto fue debido a la mayor concentración de IgE sérica específica anticaseína comparada con la anti-ALA y la anti-β-LG, ya que los pacientes estaban en su mayoría sensibilizados a las caseínas (98%) y en menor proporción a la β-LG (69%) o a la ALA (51%). El cambio en la alergenicidad también se explica por las especies de bacterias productoras de ácido láctico, la fermentación y las condiciones de almacenamiento. El grupo de Fotschki probó 3 cepas diferentes de bacterias y verificó que L. casei LcY causó la mayor disminución en la inmunorreactividad de la leche de yegua después de la fermentación, mientras que Streptococcus thermophilus MK10 causó el efecto más bajo. Bu también concluyó que la combinación de Lactobacillus helveticus y S. thermophilus indujo una disminución en la antigenicidad a la β-LG y la ALA. La fermentación con un almacenamiento en frío adecuado también parece tener un efecto interesante, ya que la actividad de los microorganismos es más alta, y producen más proteasas que contribuyen a una reducción de la antigenicidad de las proteínas. Varios autores estudiaron el efecto de la simulación de la digestión gástrica con saliva, pepsina y pancreatina/sales biliares después de la fermentación con bacterias productoras de ácido láctico. Los resultados mostraron un efecto sinérgico sobre la reducción de la inmunorreactividad con diferentes tasas en cada etapa de la digestión para cada alérgeno probado. Wróblewska mostró la fragmentación de la estructura dimérica de la ALA, la hidrólisis de la BSA y de la β-LG después de la etapa de pepsina y la degradación completa de las caseínas por el extracto de pancreatina y bilis porcina.

Un efecto de matriz parece estar involucrado en la reducción de la alergenicidad. En el estudio de Pescuma, la fermentación con Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CRL 656 mostró un mayor porcentaje de hidrólisis de la β-LG en concentrados de proteína de suero de leche en comparación con la proteína libre, lo cual es posible que se deba a la cointegración de la ALA con la β-LG, lo que aumenta su agregación, y lleva a una exposición completa de los sitios de escisión péptica. Un enfoque interesante llevado a cabo por Phromraksa fue la identificación de diferentes bacterias proteolíticas de un alimento tailandés tradicional fermentado con potenciales alergénicos reducidos. El concentrado de la enzima cruda de Bacillus subtilis reduce la alergenicidad a la β-LG, por lo que es adecuado para su uso en la producción de productos alimenticios con leche hipoalergénica. El uso de bacterias proteolíticas recibió mucha atención para su aplicación en el diseño de nuevos productos lácteos hipoalergénicos. Biscola aisló una nueva cepa proteolítica de Enterococcus faecalis de la leche bovina cruda, cuyas proteasas mostraron una fuerte actividad contra las caseínas α y β en condiciones óptimas de 42°C y a un pH de 6.5, en la leche descremada y el caseinato de sodio.

La hidrólisis enzimática se utiliza en el desarrollo de una variedad de fórmulas infantiles a base de hidrolizado de proteínas para alimentar a los bebés con alergia a la leche de vaca, y demostró ser un método efectivo para cambiar la inmunorreactividad de los alérgenos. Prioult estudió el efecto de la hidrólisis con enzimas de Lactobacillus paracasei y Bifidobacterium lactis sobre la alergenicidad de los péptidos ácidos de la β-LG bovina. Sus resultados indicaron que la capacidad de unión a la IgE se redujo mediante la hidrólisis de los péptidos de la β-LG, por medio de la represión de la estimulación de los linfocitos. Por otra parte, estos fragmentos peptídicos favorecieron la expresión para la producción de interferón-γ (IFN) e interleucina-10 (IL) de manera significativa, al reducir la expresión para la secreción de IL-4 por parte de los esplenocitos múridos. También se observó una disminución de la alergenicidad, confirmada por la degradación de proteínas, la inhibición de la degranulación de los mastocitos, una reducción del edema de la oreja y una reducción de la proliferación de las células T, en concentrados de proteína del suero de la leche después de la hidrólisis con un efecto dependiente del tiempo. Meulenbroek afirmó que en algunos pacientes este efecto relacionado con el tiempo no es evidente, lo que indica que el grado de hidrólisis no es decisivo, pero que la presencia y la estabilidad de la IgE y de los epítopos de las células T en los hidrolizados son reconocidos por pacientes individuales. Como se indicó con anterioridad, el tratamiento térmico parece aumentar el efecto de la hidrólisis enzimática debido a la posible exposición de sitios de escisión como resultado de la desnaturalización térmica y la mejoría de la susceptibilidad de la proteína a sufrir proteólisis. El peso molecular de los péptidos obtenidos después de la hidrólisis tiene también diferentes efectos sobre la alergenicidad, aunque hay un desacuerdo sobre el peso molecular óptimo para utilizarse de acuerdo con el proceso elegido de hidrólisis. La especificidad de la enzima, la sensibilidad de los pacientes contra el antígeno y la optimización de las condiciones de hidrólisis pueden alterar el efecto final sobre la alergenicidad. Por ejemplo, la digestión enzimática de la β-LG puede generar nuevas sustancias antigénicas, lo que sugiere la existencia de numerosos epítopos dispersos en algunas regiones hidrofóbicas de las moléculas que se volvieron biodisponibles después de la digestión enzimática. Por lo tanto, el desarrollo de fórmulas hipoalergénicas para los pacientes que toman leche de vaca requiere la evaluación cuidadosa de todos estos parámetros.

Digestibilidad.Durante la digestión gastrointestinal, la mayoría de las proteínas son en gran parte escindidas en todo el tracto digestivo por enzimas gastrointestinales y peptidasas del borde en cepillo del intestino para pequeños péptidos y AA. Sin embargo, algunos péptidos más grandes se conocen por sobrevivir a las duras condiciones del proceso de digestión, se absorben por la mucosa del intestino y se presentan luego al sistema inmune. Cuando una porción significativa de la proteína (péptido grande) resiste a la digestión, es más probable que se presente al sistema inmune inductivo de la mucosa, lo que aumenta su potencial de sensibilización. Una reexposición al péptido alergénico, que conserva un tamaño adecuado y la conformación adecuada para ser reconocido por las células inmunocompetentes, aumentan la probabilidad de provocar una respuesta alérgica. La ruta más común de exposición a los alérgenos alimentarios es a través del tracto gastrointestinal o la piel, lo que puede ocurrir en diferentes etapas tanto pre como posnatales. En el caso específico de la alergia a la leche de vaca, el tracto gastrointestinal es la ruta principal de sensibilización en niños, y es normal durante el primer año, aunque la exposición por inhalación (en especial en pacientes con asma) a las proteínas de la leche también podría ser relevante como sensibilizador primario.

Como ya se dijo, algunos autores combinaron la evaluación del efecto del procesamiento con la simulación de humanos in vitro de la digestión gastrointestinal para identificar fragmentos estables grandes que entran de forma masiva en contacto con la mucosa y las células inmunocompetentes.. Algunos alérgenos son resistentes a la digestión luminal gástrica e intestinal, alcanzan con facilidad la mucosa intestinal donde la absorción puede ocurrir y desencadenan una respuesta inmune. Sin embargo, algunas alteraciones en la conformación alergénica causadas por el procesamiento pueden afectar la habilidad de los alérgenos alimentarios para llegar a la mucosa yeyunal y reducir su alergenicidad. Además, la digestión intestinal puede potenciar el efecto del procesamiento sobre los alérgenos y reducir incluso aún más su alergenicidad. El tratamiento térmico, la glicación y la fermentación, cuando se combinan con la digestión gástrica simulada, producen un aumento de la digestibilidad de las proteínas de la leche y, en consecuencia, una reducción de su alergenicidad. Estudios centrados en la evaluación de diferentes modelos de digestibilidad también son muy relevantes para obtener mejores resultados. El estudio de Benedé evaluó el efecto de enzimas comerciales en comparación con fluidos humanos durante la digestión gástrica y duodenal. Este autor encontró una degradación más rápida de las β-caseínas con la producción de péptidos menos numerosos y más cortos y menor inmunorreactividad después de la digestión duodenal, en particular con las enzimas digestivas humanas. También se observó un aumento de la inmunorreactividad de las β-caseínas después de la digestión gástrica, que es mayor con la pepsina porcina comercial, lo que sugiere el desenmascaramiento de algunos epítopos IgE luego de la hidrólisis.. Sanchón comparó los péptidos obtenidos a partir de un proceso de digestión in vitro con aquellos recogidos in vivo del yeyuno humano. Los autores verificaron que las regiones de resistencia común de las proteínas de la leche fueron similares en los procesos de digestión in vitro e in vivo, lo que revela que el proceso in vitropodría presentar una buena aproximación a la digestión gastrointestinal fisiológica de las proteínas de la leche. Damodaran y Li evaluaron un enfoque enzimático en 2 pasos para reducir la inmunorreactividad de las proteínas de suero de la leche aislada y de la caseína. El método consistió en una hidrólisis parcial con diferentes proteasas (quimotripsina, tripsina o termolisina) seguido de la repolimerización con transglutaminasa microbiana. Después de una hidrólisis parcial con quimotripsina, tripsina y termolisina, los hidrolizados de proteína de suero de leche conservaron cerca de 80%, 30% y 20% de la inmunorreactividad original, lo que disminuyó en 45%, 35% y 5% tras la repolimerización, de manera respectiva. Por lo tanto, los resultados sugirieron la posibilidad de que se produzcan productos lácteos hipoalergénicos. En otro estudio realizado por Quintieri, los concentrados de proteína de suero digeridos con pepsina seguidos por ultrafiltración redujeron de manera notable la antigenicidad de los hidrolizados de suero, lo que sugiere este método como una herramienta potencial para la producción de fórmulas hipoalergénicas para alimentos infantiles.

Nuevas tecnologías de procesamiento de alimentos

Procesamiento a presiones altas. El procesamiento a presión alta (HPP) es una nueva tecnología capaz de inactivar microorganismos y enzimas en los alimentos, que mantiene su sabor original y su valor nutricional, con el uso de presiones ultraaltas por encima de 100 mPa a temperatura ambiente. Se sabe que las presiones altas alteran el estado de conformación de las proteínas de la leche, lo que lleva a un aumento de las flexibilidades, del despliegue y la agregación. Esto causa la exposición de epítopos antes enterrados en la molécula natural y aumenta la alergenicidad de las proteínas del suero de la leche, pero también aumenta la susceptibilidad de la acción de las proteasas digestivas clave con una disminución eventual de la alergenicidad. Por otra parte, la agregación de los monómeros de caseína pone al descubierto nuevos determinantes ausentes en las formas monoméricas, mostrados por una reactividad alta de la IgE de algunos pacientes sólo contra estos agregados, pero no contra sus componentes individuales. El efecto de la presión alta en las proteínas del suero es dependiente del tiempo, e influyen diferentes niveles de temperatura y de la matriz de la leche. Kleber observó que la leche descremada y el suero de leche dulce (subproducto del queso cuajado con cuajo) presentaron un aumento en su antigenicidad con el aumento de la presión y el tiempo, pero disminución de la antigenicidad con incremento de la temperatura, mientras que, en los aislados de proteína de suero de leche, la antigenicidad se mejoró en todas las condiciones de presión y temperatura probadas. La diversidad entre las tasas de alergenicidad detectadas en distintos tipos de leche y otros productos destaca la complejidad de los ingredientes alimentarios y la importancia de realizar estudios sobre el efecto de la HPP en diferentes matrices de alimentos. El tratamiento de presión alta aún no puede eliminar por completo la alergenicidad de manera directa, pero la combinación con otras estrategias puede dar lugar a posibles soluciones, tales como la HPP junto con hidrólisis enzimática. López-Expósito demostró que los hidrolizados de β-LG (obtenidos con la digestión con quimotripsina y pepsina) perdieron su alergenicidad como lo revela la ausencia de reacciones anafilácticas, activación de mastocitos y la disminución de la temperatura corporal. Una nueva estrategia llamada “caída instantánea de la presión controlada” (DIC) que combina el efecto de la presión con el de la temperatura alta en un periodo breve de tiempo, seguida de una caída instantánea de la presión hasta el vacío también se probó. Se causó un aumento de la alergenicidad de las caseínas y una reducción en la inmunorreactividad de las proteínas del suero de leche por la disociación de las micelas de caseína o la agregación de los monómeros de la caseína y por los cambios en la estructura molecular terciaria y secundaria de las proteínas del suero de la leche, de manera respectiva. El desarrollo de fórmulas lácteas hipoalergénicas después de la HPP, combinadas con un tratamiento térmico o con hidrólisis enzimática, puede reducir la alergenicidad de la leche y mantener la calidad sensorial y su valor nutricional.

Irradiación de alimentos. La irradiación de alimentos utiliza radiación ionizante con rayos X, haces de electrones de alta energía (partículas β) o rayos “γ” para la esterilización de alimentos, para mejorar así la seguridad y la estabilidad al almacenamiento sin comprometer la calidad nutricional o sensorial, al aplicarse a dosis apropiadas. La irradiación crea cambios en la capacidad de unión de la IgE con el alérgeno, mediante la inducción de la desnaturalización estructural, de la fragmentación y/o la agregación de proteínas y al menos con la destrucción de epítopos de la IgE. Con la irradiación γ, Lee redujo 7 veces la alergenicidad de la β-LG con éxito. Meng también demostró el potencial bajo de alergenicidad in vivo de la ALA irradiada al encontrar una disminución de los niveles de IgE específica para la ALA, la inhibición de los mastocitos y la activación de los basófilos, además de haber una disminución significativa de los niveles de histamina y una reducción de las reacciones anafilácticas en ratones.

Radiación ultravioleta e infrarroja. Se observaron efectos similares en los cambios de las estructuras de los epítopos conformacionales de los alérgenos de la leche después de la aplicación de radiación ultravioleta (UV) e infrarroja (IR). La radiación UV se usa como un agente bactericida desde el año 1928. Desde hace poco, la industria alimentaria la utiliza como agente desinfectante y sanitizante. Del mismo modo, la radiación IR puede inactivar a los microorganismos al dañar los componentes intracelulares, tales como el ADN, el ARN y los ribosomas en la célula y modificar la estructura de las proteínas en los alimentos. De acuerdo con Hu, la alergenicidad de las α-caseínas disminuyó después de 15 minutos de tratamiento con rayos UV-C y 5 minutos luego del tratamiento con rayos IR lejanos, siendo el primer tratamiento más eficiente según pruebas de digestión simuladas que lo comprueban. Tammineedi también demostró una reducción en la alergenicidad de las α-caseínas y las proteínas del suero de la leche en 25% y 27.7%, de manera respectiva, después de 15 minutos del tratamiento con rayos UV-C. Sin embargo, parece que estas alteraciones no son suficientes para la producción de fórmulas hipoalergénicas. La radiación de microondas combinada con hidrólisis enzimática podría ser una alternativa para reducir la antigenicidad de las proteínas de la leche, según algunos estudios que reportaron resultados interesantes.

Otras tecnologías. El ultrasonido ganó mucha atención porque parece tener un efecto sobre la alergenicidad del camarón y los alérgenos de la soya. Esta nueva tecnología altera la conformación y la reactividad de los alérgenos por la implosión de burbujas formadas por sonicación durante el proceso, lo que causa presión alta y temperatura localizadas. Sin embargo, el ultrasonido parece no tener ningún efecto en la reducción de la alergenicidad de las proteínas de la leche, según lo establecieron Stanic-Vucinic y Tammineedi/Choudhary.

La aplicación de plasma atmosférico no térmico también reveló una falta de efecto alguno sobre la α-caseína y la alergenicidad de las proteínas del suero, a pesar de los avances recientes en la reducción de la alergenicidad al camarón y al trigo. Como se demostró, destruye principalmente la estructura 3D y los epítopos conformacionales de las proteínas, sin causar un daño selectivo de los epítopos IgE alergénicos.

La modificación genética de los residuos clave en los sitios de unión a los alérgenos, sin interrumpir la estructura global, sería una posible solución para la inmunoterapia específica para los alérgenos. Hasta ahora, se estudiaron 2 mutaciones en los epítopos mayores de la β-LG, es decir, Ala86Gln y Lys69Asn. Los resultados indicaron que ambas proteínas que mutaron son reconocidas como con 9 veces menos potencia por la IgE en los pacientes alérgicos a la leche de vaca que con la β-LG natural o recombinante. Las mutaciones fueron responsables de la desaparición de los epítopos importantes, y, en consecuencia, de la reducción de la unión de la IgE a la β-LG mutada.

Se realizaron muchos esfuerzos para estudiar el efecto del procesamiento sobre la alergenicidad de las proteínas de la leche, con resultados prometedores que mostraron la aplicabilidad de estas tecnologías en la producción de fórmulas hipoalergénicas. Por otra parte, parece que todas las características sensoriales y nutricionales se mantienen, y ocurre lo contrario en algunos procesos convencionales, como el tratamiento térmico y la hidrólisis enzimática. La aplicabilidad de otras tecnologías novedosas de procesamiento como luz ultravioleta pulsada, campo eléctrico pulsado y tratamiento óhmico, aún no se evalúan en la alergenicidad a la leche, pero podrían ser enfoques interesantes en un futuro cercano.

Métodos analíticos para la detección de los alérgenos de la leche en alimentos procesados

Una mayor conciencia sobre las implicaciones para la salud pública de las alergias alimentarias dio lugar a la necesidad de desarrollar metodologías analíticas para controlar la presencia de ingredientes alergénicos ocultos en los alimentos procesados, y permitir el reforzamiento de las regulaciones del etiquetado. Los consumidores alérgicos tienen una dependencia total y están en apariencia protegidos por la información de las etiquetas de los alimentos procesados. Sin embargo, la exposición accidental a alérgenos ocultos en los alimentos debido a un etiquetado incorrecto o a la contaminación cruzada durante el procesamiento de los alimentos constituye un riesgo real para estas personas. Las proteínas lácteas a menudo se emplean como ayudas tecnológicas y, por lo tanto, están presentes en varios tipos de alimentos como un ingrediente. Sin embargo, debido a la práctica común de utilizar líneas de producción compartidas para fabricar diferentes formulaciones de alimentos, es muy probable que se produzcan contaminaciones cruzadas accidentales. Para aumentar el bienestar y la seguridad de las personas sensibilizadas, deben declararse todos los ingredientes con potencial alergénico sin tomarse en cuenta su cantidad en todos los productos alimentarios de consumo humano. Por lo tanto, las metodologías analíticas apropiadas y de sensibilidad alta representan recursos esenciales para ayudar en el manejo industrializado de los alimentos alergénicos y para facilitar, de manera subsecuente, el control y el monitoreo de los alérgenos por parte de las autoridades reguladoras.

La elección del mejor método para el análisis de los alérgenos depende de criterios específicos, tales como el analito diana (proteínas o ADN), la base de la detección (química o biológica), el costo por ejecución/análisis, la configuración, los fenómenos de reactividad cruzada, la necesidad de conocimiento especializado y la posibilidad de detección multitarea.

Además, son requisitos importantes una sensibilidad y especificidad apropiadas rastrear cantidades minúsculas en matrices complejas de alimentos. El límite ideal de detección (LOD) para los alérgenos en productos alimenticios se considera en el rango de 1 a 100 mg/kg, aunque estos valores de referencia en la actualidad están en revisión. Morisset estableció un umbral de reactividad clínica a la leche de 30 mg/kg para las proteínas de la leche, para garantizar 95% de seguridad para los pacientes que son alérgicos, basado en el consumo de 100 gramos de producto. De manera reciente, con modelos estadísticos apropiados de distribución de dosis, la dosis de referencia para la leche se definió como 0.1 miligramos de proteína, al considerar la dosis apropiada que protege a 99% de la población de pacientes alérgicos a la leche (ED₀₁). De acuerdo con los factores de conversión disponibles por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norte América, esta dosis de referencia representa 3.03 mg de leche líquida por kg de alimento y 0.28 mg de leche grasa no seca por kg de alimento. En la actualidad, hay varias posibilidades técnicas para la detección de alérgenos lácteos en los productos alimenticios, los adelantos recientes se resumen en la Tabla 5.

Métodos basados en proteínas

Los métodos clásicos basados en proteínas son todavía los utilizado de forma más común para la detección de alérgenos en los alimentos. Se basan en las interacciones alérgeno-anticuerpo y están disponibles en diferentes formatos, como los dispositivos de flujo lateral (LFD), las pruebas de tiras reactivas, las pruebas de enzimas ligadas a inmunosorbentes (ELISA) y las pruebas de inmunotransferencia. En la actualidad, las tecnologías de punta logran un servicio particular para el análisis de alérgenos, ya sea con los inmunosensores y las plataformas de espectrometría de masas (EM).

Inmunoensayos. Los anticuerpos desempeñan un papel importante en la mayoría de los métodos de detección de alérgenos debido a su unión específica con sus respectivos antígenos, que crean sistemas muy sensibles y específicos. La mayoría de los inmunoensayos para la detección de alérgenos de la leche se basan en ELISA, que puede proporcionar resultados cuantitativos por medio de la comparación de señales ópticas o fluorescentes de las muestras desconocidas con curvas estándar. Están disponibles en diferentes formatos, tales como el ELISA directo, el ELISA indirecto, el ELISA competitivo pese a que el ELISA de tipo sándwich es el más utilizado.

En la actualidad, debido a la mayor demanda de pruebas rápidas y confiables para la detección de alérgenos específicos en los alimentos, varios kits comerciales de ELISA ingresaron al mercado (Tabla 6). Estos kits son capaces de detectar proteínas específicas, tales como las caseínas y las β-LG, o a las proteínas totales de la leche con valores de LOD reportados que varían de 0.015 a 2 mg/L, aunque el tipo de matriz de los alimentos y el efecto del procesamiento pueden afectar estos valores. El calentamiento puede provocar la formación de agregados insolubles proteicos, que pueden ser indetectables mediante ELISA. Además, la interacción con los compuestos de la matriz alimentaria y las diferencias en el reconocimiento de anticuerpos de las proteínas desnaturalizadas por el calor pueden afectar en la detección y, en particular, la determinación cuantitativa de las proteínas de los productos alimenticios. Por lo tanto, la selección cuidadosa del kit apropiado es siempre necesaria. La tabla 6 representa la lista de los ELISA disponibles en el comercio para la detección de los alérgenos de la leche. La tabla 5 no sólo muestra la información en relación con la aplicación de los kits disponibles para determinar la detección o la cuantificación de la leche en diversos productos, sino también las pruebas internas de desarrollo tipo ELISA. Dewark desarrolló dos sistemas (sándwich directo e indirecto por ELISA) para la detección de caseínas en los vinos rojo y blanco, y alcanzó como meta un LOD entre 10 y 200 μg/L. Las sensibilidades reportadas estuvieron de acuerdo con el umbral de 0.25 mg/L solicitadas por la OIV (Organización Internacional de la Viña y el Vino, París, Francia) para buscar la presencia de agentes clarificantes (leche, caseína, ovoalbúmina) en los vinos. Su trabajo también demostró la influencia de una matriz alimentaria compleja en el desarrollo de este tipo de prueba. El desarrollo de 2 tipos de formatos (competitivo indirecto y tipo sándwich) se realizó por Luis y colaboradores en 2009 para la detección de la β-LG en los alimentos procesados. Los sistemas competitivos y de sándwich tienen un LOD de 0.5 y 0.05 mg/kg, de manera respectiva, los cuales fueron capaces de detectar ingredientes no declarados de leche en 14% de las muestras comerciales sujetas a pruebas. El formato tipo sándwich probó que es más específico y sensible por afectarse menos por la matriz que la forma competitiva indirecta.

La LFD es otra prueba inmunoquímica rápida y específica para la detección de alérgenos. El principio del método es similar al de ELISA, pero permite un desarrollo más simple y rápido con resultados disponibles tanto de forma cuantitativa como cualitativa que pueden ser interpretados de manera visual. La falta de información cuantitativa y la susceptibilidad de estos aparatos para dar resultados falsos-negativos son los mayores inconvenientes asociados con su uso. Sin embargo, se aplican con mucha frecuencia en la industria alimentaria para monitorear la limpieza de los equipos de procesamiento de alimentos y de la contaminación de los productos alimentarios. Hay muchos kits de LFD en el mercado que pueden detectar a los alérgenos lácteos en los productos alimentarios en pocos minutos en el mismo lugar, con LODs menores de 0.5 mg/L, tal como se demuestra en la tabla 6.

Los biosensores se consideran como herramientas emergentes para la detección de alérgenos por el hecho que son rápidos, repetibles y de sensibilidad alta, con un gran potencial para una automatización completa. De forma breve, los biosensores se basan en el reconocimiento directo de una interacción biológica entre un receptor (anticuerpo o sondas) y una molécula diana (proteína o ADN) por medio de un transductor que produce una señal medible. Muchos estudios se desarrollaron con inmunosensores SPR para detectar los alérgenos lácteos en diferentes matrices de alimentos, y alcanzaron sensibilidades de 1 mg/L a 0.12 mg/mL. Los inmunosensores electroquímicos también se usan para la detección de proteínas lácteas. Eissa en 2012 desarrolló un inmunosensor capaz de detectar por debajo de 0.85 pg/mL de β-LG en productos alimenticios, el cual es el LOD más bajo para esta proteína mediante la medición con inmunosensores electroquímicos (Tabla 5). Sin embargo, en relación con el hecho de que estos sistemas se basan en la interacción biológica entre un anticuerpo y su respectiva proteína alergénica/marcadora, una interpretación cuidadosa es siempre necesaria para evitar resultados falsos positivos o falsos negativos.

En general, los inmunoensayos son capaces de detectar las proteínas alergénicas mayores de la leche, como a la ALA o a la β-LG, en una variedad amplia de matrices alimentarias. Sin embargo, aún falta el desarrollo de información para determinar la presencia de proteínas hidrolizadas de la leche en los alimentos, ya que conservan su inmunorreactividad. Además, se realizaron pocos estudios para evaluar la inmunorreactividad del suero puro y de los hidrolizados con caseína, pero estos no tienen aplicación para la detección de péptidos de las proteínas hidrolizadas de la leche en diferentes matrices de alimentos.

Plataformas EM. La EM desempeñó un rol importante en la investigación proteómica y se probó que es una técnica analítica fuerte para el análisis de los péptidos y las proteínas, que ayuda en la identificación, la caracterización y la determinación de los alérgenos alimentarios. Las plataformas de EM ofrecen muchas ventajas como la rapidez, la precisión, la sensibilidad, la especificidad y la reproductibilidad. Su sensibilidad es comparable con ELISA y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), lo que permite una detección multitarea de una sola vez con especificidad alta. De manera adicional, los problemas relacionados con la reactividad cruzada que se asocian con frecuencia con los inmunoensayos se eliminaron ya que la detección de la proteína/péptido diana no requiere la interacción con el receptor biológico (anticuerpo), lo que resulta en la identificación inequívoca y directa de los analitos diana. El análisis proteómico de una muestra consiste con frecuencia en la separación en una o varias etapas a nivel proteico o peptídico (electroforesis de gel, cromatografía líquida), seguida del análisis con EM. Existen 2 abordajes distintos para la detección del alérgeno, así como para su cuantificación y caracterización: el abordaje “ascendente” donde las proteínas se digieren con enzimas como la tripsina antes del análisis con EM y el abordaje “descendente”, donde las proteínas completas se fragmentan de manera directa dentro del espectrómetro de masas, para evitar el paso variable de la digestión de proteínas. El abordaje ascendente es el más utilizado debido a la limitación actual del desempeño de los instrumentos del abordaje descendente.

Hay un número creciente de reportes sobre la detección de alérgenos lácteos en alimentos por medio de tecnologías de EM. La mayoría de estos trabajos utilizan enfoques multitareas, que permiten la discriminación de diferentes alérgenos lácteos (caseínas, ALA y β-LG) en diferentes matrices de alimentos, tales como vinos, galletas, fórmulas infantiles y los productos de panadería, con sensibilidades que van desde 0.01 a 5 mg/kg (Tabla 5). De manera muy reciente, Ji y colaboradores desarrollaron un método tipo LC-tandem de EM (LC-EM/EM) para la confirmación y la cuantificación de 3 alérgenos lácteos (ALA, β-LG y αS1-caseína) en diferentes productos alimenticios que son: galletas, biscochos, gofres, pastelerías, pastel de yema de huevo entre otros, con un LOD reportado de 0.2 mg/kg para la β-LG y la αS1-caseína y de 0.39 mg/kg para la ALA. Se obtuvieron sensibilidades similares por Losito, cuyo método, basado en la trampa de EM de iones de ionización por electropulverización LC (LC-ESI-ITMS), fue capaz de detectar al caseinato en niveles traza en diferentes vinos blancos italianos, con un LOD que va desde 0.09 a 0.29 mg/L, de acuerdo con el vino.

Al igual que en los métodos inmunoquímicos, la matriz alimentaria también afecta a la sensibilidad de los métodos de EM. En consecuencia, los valores del LOD reportados son mayores para el análisis de alérgenos en matrices complejas de alimentos, tales como en los chocolates. El efecto del procesamiento de los alimentos en los alérgenos diana también debe tenerse en cuenta ya que su estructura se sabe que se afecta de manera diferente por distintos tipos de procesamiento, que requiere la identificación de péptidos marcadores en el alimento crudo y las matrices procesadas. El procesamiento de los alimentos altera la capacidad de extracción y la solubilidad de las proteínas alergénicas o de otras proteínas marcadoras, que pueden comprometer el buen desempeño del método basado en la EM. Sin embargo, las ventajas de su precisión alta, su especificidad y del análisis multitarea hacen que las plataformas de EM se utilicen de manera más amplia para el análisis de alérgenos frente a los ensayos inmunoquímicos clásicos.

Métodos basados en el ADN

De manera reciente, se recibieron con interés creciente algunos métodos basados en el ADN para la detección de alérgenos, debido a su especificidad alta, sensibilidad y de la independencia de los posibles efectos biológicos asociados con la producción de anticuerpos y por una estabilidad térmica alta de las moléculas de ADN, en particular de aquellas relevantes para analizar los alimentos procesados. Por lo tanto, los métodos basados en el ADN demostraron ser excelentes alternativas frente a los métodos basados en proteínas, en especial cuando se analizan los alimentos con procesamientos altos. Las dianas del ADN podrían ser genes que codifican proteínas alergénicas u otras secuencias específicas, por lo que se consideran como marcadores indirectos de la presencia de un ingrediente alergénico. La mayoría de los trabajos publicados que utilizan los métodos basados en el ADN consisten en la amplificación de las secuencias diana iniciales de ADN por PCR con el uso de cebadores específicos, responsables de conferir un nivel alto de especificidad a los ensayos Los principales enfoques utilizados para la detección de alérgenos son el punto final de la PCR, la PCR multiplex, y la PCR en tiempo real, así como de la PCR-ELISA, pero de manera reciente nuevos avances prometedores ganaron mucho interés, como el análisis de fusión de resolución alta de PCR acoplado en tiempo real (HRM), el PCR en tiempo real anidado de un solo tubo, las matrices de ADN y los  genosensores. La mayoría de los reportes aplican métodos basados en el ADN para la autenticación de los productos lácteos, como los quesos, y para la identificación de diferentes especies que se encuentran en los productos lácteos. En contraste, pocos estudios describen la detección de alérgenos lácteos en productos alimentarios, donde la PCR en tiempo real es la técnica principal utilizada para este propósito.. Los métodos de PCR en tiempo real tienen la ventaja de proporcionar resultados cuantitativos con un costo de instalación más adecuado, un tiempo de funcionamiento razonable y requerimientos moderados por parte del personal y de equipos especializados. Koppel desarrolló 2 sistemas hexaplex de PCR en tiempo real y 2 tetraplex con sondas TaqMan para la detección simultánea de varios alérgenos en los alimentos, como los alérgenos lácteos (Tabla 5). Los métodos mostraron buena especificidad, con sensibilidad de hasta 0.64 μg/ml de ADN bovino. Xiao desarrolló un método en tiempo real de PCR con una sonda de ligante de surco menor TaqMan para la detección específica del gen ALA en alimentos. El método mostró una sensibilidad de 0.05 ng de ADN bovino (Figura 3) y se aplicó a 42 muestras comerciales para verificar el cumplimiento que tenían las etiquetas para reportar la presencia de la leche como ingrediente.

Observaciones finales

La preocupación por la alergia a la leche aumentó en los últimos años, principalmente porque la mayoría de los individuos afectados son infantes menores de 3 años. Al presente, no hay un tratamiento para las alergias alimentarias y, en consecuencia, los individuos sensibilizados tienen que evitar los productos lácteos y todos los productos alimenticios que contengan derivados lácteos. En el caso de exposición accidental, pueden utilizarse diferentes productos farmacéuticos (antihistamínicos H1 y H2, los agonistas beta-2 o los glucocorticoides) para aliviar los síntomas clínicos asociados con las respuestas inmunológicas adversas, aunque la epinefrina es la más usada de forma común para tratar las reacciones alérgicas muy graves y que ponen en riesgo la vida (anafilaxia).

Se realizaron avances recientes en el desarrollo de estrategias efectivas para tratar la alergia a la leche e inducir tolerancia en los pacientes alérgicos. La inmunoterapia oral (ITO) parece ser un enfoque prometedor, con una tasa de éxito que varía entre 37% y 70%. Otro enfoque se centra en la reducción de la alergenicidad de la leche mediante el uso de nuevas tecnologías de procesamiento de los alimentos. Dicho procesamiento induce cambios en las proteínas de la leche que pueden afectar en gran medida su susceptibilidad a la digestión gastrointestinal, la cinética de su absorción y, en consecuencia, su inmunorreactividad. Por lo tanto, el potencial alergénico de las proteínas de la leche puede disminuirse al seleccionar los parámetros apropiados durante su procesamiento. A pesar de las reducciones reportadas en la alergenicidad con algunos tipos de procesamiento, ningún método es efectivo por completo. Debido a las diferencias en el grado de reacciones alergénicas y en la tolerancia entre los diferentes pacientes, es importante llevar a cabo más estudios in vitro e in vivo para probar las diferentes condiciones y combinaciones de métodos de procesamiento de la leche.

Para mejorar la protección del consumidor y garantizar la calidad de vida de las personas sensibilizadas, se establecieron varias normativas y directivas, que establecen la obligación de etiquetar los alimentos e ingredientes alimentos con potencial alergénico, como la leche. Así, es imperativo el desarrollo de metodologías para detectar y cuantificar los alérgenos para permitir la aplicación y ejecución de las normas de etiquetado y controlar la presencia de ingredientes alergénicos ocultos. La técnica de ELISA es un método sensible y específico para la detección de proteínas de la leche en los productos alimenticios, aunque tiene la limitación de afectarse en gran medida por el procesamiento de los alimentos que podrían conducir a resultados falsos negativos. También se aplican los inmunosensores, que resultan en análisis rápidos, repetibles y con probabilidad de ser automatizados en su totalidad. Las plataformas de EM, como la LC-EM/EM, demostraron su eficacia en la detección de proteínas y péptidos alergénicos de la leche, que pueden utilizarse como una herramienta de confirmación para la identificación de múltiples alérgenos. Los métodos basados en el ADN, a pesar de consistir en un enfoque de detección indirecta, se consideran alternativas eficientes, son menos propensos a afectarse por el procesamiento de los alimentos. La capacidad de los métodos para detectar niveles traza de alérgenos en los productos alimenticios depende de muchos factores, como la matriz alimentaria, el método de extracción, la operación del procesamiento de los alimentos y la forma en que está presente el alérgeno. A pesar de estas limitaciones, los métodos disponibles en la actualidad para la detección de los alérgenos de la leche desempeñan un papel crucial en el suministro de información para los consumidores alérgicos, lo cual es esencial para llevar una dieta de eliminación necesaria para proteger su salud.

Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 

 

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Bovine Milk Allergens: A Comprehensive Review

Caterina Villa 

 

Joana Costa 

 

Maria Beatriz P.P. Oliveira 

 

Isabel Mafra

First published: 13 November 2017

 

https://doi.org/10.1111/1541-4337.12318

Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL Monterrey, México

Dra. Med. Sandra Nora González Díaz        Jefe y Profesor

Dr. Dr. José Ignacio Canseco Villarreal        Profesor

Dr. Ivan Omar Peñafiel Quinteros               Residente 1er Año

Dra. Alejandra Macías Weinmann                Profesor