miércoles, 30 de noviembre de 2016

Alérgenos de Alternaria alternata: Marcadores de exposición, filogenia y riesgo de alergia respiratoria inducida por hongos

1. Introducción
Alternaria alternata es uno de los saprófitos más comunes encontrados a nivel mundial, y se asocia de forma clínica con asma, rinosinusitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, oculomicosis, onicomicosis, infecciones de la piel, y micosis alérgica broncopulmonar. Aunque existe un amplio rango de manifestaciones clínicas, A. alternata rara vez se encuentra como causa de infecciones invasivas en humanos. Esta especie fúngica se relaciona principalmente con la inducción de enfermedades respiratorias mediadas por inmunoglobulina E (IgE). Las esporas de A. alternata se consideran como una de las fuentes más potentes y abundantes de aeroalérgenos sensibilizantes. La exposición más intensa a alérgenos de A. Alternata probablemente ocurre en el exterior; sin embargo, Alternaria y otros hongos alergénicos pueden colonizar interiores y por tanto aumentar el nivel de exposición.

La prevalencia real de sensibilización de A. alternata es difícil de estimar, y varios estudios epidemiológicos y diagnósticos reportan una prevalencia muy variable de reactividad de IgE humana a Alternaria. La Encuesta de Salud Respiratoria de la Comunidad Europea encontró que 4.4% de la población adulta en general (n = 11,355) están sensibilizados a Alternaria. De manera más reciente, en un estudio grande de pruebas cutáneas patrocinado por la Red Europea Global de Asma y Alergia (GA(2)LEN), que involucró 3034 pacientes con sospecha de alergia a aeroalérgenos (mediana de edad: 33 años) de 17 centros en colaboración localizados en 14 países europeos, la prevalencia de sensibilización a Alternaria fue de aproximadamente 9% con tasa de sensibilización que variaba desde 2% (Finlandia) hasta 23.8% (Grecia). De entre una población sensibilizada a hongos, más de 60% presentó reacción a extractos diagnósticos de A. alternata.
Hay algunos grupos de población en los que las tasas de sensibilización a A. alternata son mucho mayores. La sensibilización a hongos, en particular a A. alternata, parece ser mucho más prevalente en la población asmática. Los pacientes menores con alergia respiratoria parecen tener mayor riesgo de sensibilización a A. alternata que los mayores. Los trabajadores de granja o aserradero también se reportan en riesgo alto de enfermedad ocupacional de la vía aérea causada por A. alternate debido a que se encontraron niveles significativos del alérgeno de A. alternata en granjas.
Es bien conocido que la mayoría de los individuos sensibilizados a A. alternata presentan manifestaciones alérgicas que requieren atención médica. En particular, en el estudio GA(2)LEN, los síntomas clínicamente relevantes se notaron de forma clara en 69% de los pacientes europeos sensibilizados a Alternata. La gravedad de las reacciones alérgicas típicas varía desde leve a potencialmente mortal, y depende de varios factores internos y externos. La reacción más grave a alérgenos de A. alternata es el asma grave caracterizada por afección de la función pulmonar con exacerbaciones frecuentes que pueden resultar en la muerte. De hecho, la sensibilización a A. alternata se reporta asociada de forma inequívoca con la gravedad del asma, internamientos a terapia intensiva por asma y muertes relacionadas a asma.
Debido al aumento en el reconocimiento de A. alternata como un poderoso inductor de alergia respiratoria, se propuso que al menos algunos de los alérgenos de A. alternata podría tener un papel en los mecanismos subyacentes de la gravedad de la alergia. Por lo tanto, la definición completa y la comprensión del reportorio de alérgenos de A. Alternata parece ser crucial para encontrar una explicación al porqué la sensibilización a A. Alternata es un factor de riesgo para el asma. El estudio de los componentes proteicos alergénicos de este hongo puede además dar pistas valiosas para entender el interesante hallazgo reciente que Alternaria activa el sistema inmunológico innato y mejora la inflamación pulmonar inducida por alérgenos no relacionados como polen de pastos. Aunque es bien conocido que existen asociaciones irrefutables entre la sensibilización a otros aeroalérgenos prevalentes, como los ácaros y el polen, y las exacerbaciones de asma, un estudio transversal de la Encuesta de Salud Respiratoria de la Comunidad Europea encontró que la mayoría del asma se asociaba con más fuerza a la sensibilización a hongos, principalmente A. alternata, que con sensiblización a otros aeroalérgenos, como pólenes. Sin embargo, comparado con otras fuentes alergénicas en el medio ambiente, los hongos, en particular A. alternata, son una fuente desatendida y subestimada de alérgenos.
Al considerar los datos mencionados de forma previa, hay una necesidad clara de identificar la gama completa de componentes alergénicos de A. Alternata y elucidar el papel de estas proteínas en el desarrollo de alergia respiratoria desde su perspectiva biológica, diagnóstica, pronóstica y tratamiento. Al momento, se caracterizó un total de 17 proteínas alergénicas de A. alternata en plataformas de alérgenos. La lista de alérgenos de A. alternata incluye proteínas restringidas a un número pequeño de especies de hongos relacionados de manera taxonómica a A. alternata y proteínas ubicuas que se conservan durante el proceso evolutivo; estas proteínas presentan sus homólogos en diferentes familias de hongos. La existencia de múltiples alérgenos homólogos en el reino fúngico que cargan epítopos de reacción cruzada que son estructuralmente indistinguibles de epítopos de unión a IgE podría provocar un problema considerable en el diagnóstico y la clasificación de las alergias fúngicas. En apoyo a este hallazgo, existe evidencia que muestra que la aparente sensibilización a múltiples hongos representa una observación clínica frecuente en pacientes sensibilizados a A. alternata y podría ser una consecuencia de la existencia de reactividad cruzada IgE entre las proteínas fúngicas.
En estudios filogenéticos recientes se clarificó que la reactividad clínica por IgE refleja la distribución taxonómica de las fuentes alergénicas fúngicas en la mayoría de los casos. Por lo tanto, se deben caracterizar y analizar los alérgenos fúngicos de manera individual con respecto a las familias de proteínas, la distribución taxonómica y la variabilidad entre especies. De esta manera, establecer relaciones entre alérgenos de A. alternata y sus homólogos expresados por otras especies fúngicas alergológicamente importantes podría dar valiosa información para definir una categorización taxonómica de las fuentes alergénicas de los hongos y una clasificación para los alérgenos fúngicos. La definición de los alérgenos como marcadores moleculares podría contribuir al entendimiento de su papel potencial en la biología fúngica, mejorar las decisiones diagnósticas al predecir reactividad cruzada, y desarrollar herramientas de detección más robustas para evaluar los niveles de exposición a los alérgenos. Evaluar la exposición a aeroalérgenos en el medio ambiente de manera correcta es de suma importancia para predecir el riesgo de síntomas respiratorios en una población atópica, e informar la implementación de medidas apropiadas de salud pública. El uso de alérgenos específicos como herramientas para detectar contaminantes alergénicos con exactitud y por ende permitir identificar la fuente alergénica fúngica parece ser una estrategia prometedora.
La intención de esta revisión es enfocarse en los asuntos relevantes sobre la sensibilización a A. alternata y sus alérgenos, así como su caracterización inmunológica y la relevancia clínica de los alérgenos identificados hasta la fecha, las relaciones filogenéticas basadas en los alérgenos homólogos y los avances en la evaluación de la exposición a A. alternata y el diagnóstico de sensibilización fúngica.
2. Alérgenos de Alternaria alternata y prevalencia de su sensibilización
Se realizó investigación significativa para identificar y caracterizar las proteínas involucradas en la alergia a A. alternata. Los alérgenos de Alternaria son un grupo diverso de moléculas que poseen diferente propiedades químicas y biológicas. A la fecha, se identificaron y aislaron 17 proteínas de A. alternata con reacción a IgE. Doce de ellas cumplen los criterios del Subcomité de Nomenclatura de Alérgenos de la Organización Mundial de la Salud y la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas.
Los alérgenos de A. alternata reconocidos hasta la fecha, así como su relevancia clínica sobre alergia a A. alternata se discuten en extenso a continuación.
2.1. Alt a 1
Alt a 1 se localiza de forma predominante en la pared celular de las esporas de Alternaria que acceden al tracto respiratorio y ocasionan reacciones alérgicas en pacientes afectados por alergia a hongos. Se considera un marcador de sensibilización primaria a A. alternata y es sin duda el alérgeno de A. alternata caracterizado de manera más extensa. La población alérgica a A. alternata presenta aproximadamente un 80% de prevalencia de sensibilización a Alt a 1. Este alérgeno se libera en cantidades considerables por A. alternata y especies relacionadas, y esto explica con más probabilidad porqué Alt a 1 muestra valores altos de incidencia en la sensibilización entre una población sensibilizada a hongos.
Alt a 1 natural es un dímero de 30 kilodaltones (kDa) que se disocia en subunidades 16.4 y 15.3 en condiciones reductoras, lo que sugiere que un enlace disulfuro une los monómeros. Las investigaciones por medio de dinámica molecular sugieren que Alt a 1 posee una estructura dimérica muy estable que presenta epítopos con una orientación adecuada para reacción cruzada IgE comparado con otros alérgenos mayores como Bet v 1 y Pru p3. Se identificaron dos epítopos lineales (K41-P50 y Y54-K63) que muestran reactividad consistente con IgE sérica de un paciente alérgico a Alternaria en la secuencia de proteínas Alt a 1. De manera reciente, la forma recombinante de Alt a 1 se utilizó para analizar la estructura tridimensional de la molécula por cristalografía por rayos X. En este trabajo, la proteína de Alt a 1 presentó una estructura dimérica de barril beta, un pliegue completamente nuevo de alérgenos que de manera potencial define una nueva familia de proteínas fúngicas con una función desconocida. Aunque se desconoce la función de este alérgeno mayor, la evidencia creó algunas hipótesis para el papel de esta proteína en la biología fúngica:
a) La liberación de Alt a 1 se detectó como significativamente mayor en esporas germinadas de Alternaria, lo cual indica que los alérgenos pueden involucrarse en la germinación de las esporas.
b) Su homólogo A. brassicicola se encontró expresado de forma alta durante un proceso infeccioso por A. thaliana.
c) Se encontró que Alt a 1 induce la expresión de proteínas de defensa de las plantas que pertenecen a la familia PR5-TLP e interactúa con el como un inhibidor competitivo.
Los últimos dos hallazgos sugieren que el papel de Alt a 1 se puede relacionar a la virulencia e patogenicidad de infección fúngica.
Alt a 1 es una proteína conservada altamente específica para Alternaria y su taxa porque los homólogos de Alt a 1 se han reportado en otras especies de Pleosopaceae. Una numerosa lista de genes y proteínas de Alt a 1 y similares a Alt a 1 se depositaron en bases de datos.
2.2 Alt a 3 y Alt a 5
El primer reporte de Alt a 3 y Alt a 5 como alérgenos menores ocurrió cuando De Vouge y colaboradores clonaron dos secuencias que codifican fragmentos de unión a IgE de alérgenos de A. alternata por cribado de la genoteca de cDNA de A. alternata con el suero de pacientes sensibles a A. alternata. El fragmento de unión a la IgE que presentó nivel alto de homología en comparación con una región cercana a la proteína de choque térmico de C-terminal de 70 kDA deCladosporium herbarum se reconoció en inmunoblot de 5% de los sueros de pacientes sensibilizados de A. alternata y se nombró de manera oficial Alt a 3. Los miembros de la familia de proteínas HSP 70 se conservan entre organismos procarióticos y eucarióticos y tienen un papel importante en la protección de la célula durante el estrés térmico y oxidativo.
El segundo fragmento alergénico de A. alternata clonado por De Vogue y colaboradores (Alt a 5) se identificó como perteneciente a la familia P2 de proteínas acídicas ribosomales, y la proteína recombinante tuvo reactividad positiva a IgE por inmunoblot con 14% de los sueros de pacientes atópicos. De manera biológica, estas proteínas se conocen como componentes ribosomales involucrados en interacciones con factores de elongación durante el curso de la síntesis proteica.
2.3 Alt a 4, Alt a 7 y Alt a 10
Achatz y colaboradores identificaron, clonaron y caracterizaron alérgenos de Alt a 4, Alt a 7, y Alt a 10.
Alt a 4 es una proteína de A. alternata de 57 kDa que se une a IgE en 42% de una población sensibilizada a A. alternata. A su vez, Alt a 7 se identificó como una proteína de Alternaria de 22 kDa muy homóloga a la levadura YCP4, que se une a IgE del 7% de los pacientes sensibilizados a Alternaria. Un aldehído deshidrogenasa de 11kDa (Alt a 10) fue reactiva con 2% de la misma población sensibilizada a Alternaria.
2.4 Alt a 6
El cDNA que codifica para la enolasa de A. alternata se clonó por dos grupos de investigadores con un abordaje similar que consistió en una revisión de la genoteca de cDNA con un fragmento de C. Herbarum como prueba. En uno de estos estudios, una prueba cutánea con proteína recombinante mostró una respuesta positiva en 2 de 7 alérgicos a Alternaria. En el segundo estudio, Alt a 6 en blot recombinante purificada se reconoció por 22% de los sueros de pacientes sensibilizados a A. alternata. De manera reciente, se encontró una prevalencia similar a Alt a 6 en pacientes con alergia a A. alternata (n = 30) con la aplicación de diagnóstico basado en componentes. La enolasa nativa pruficada de un extracto de A. alternata posee alta termoestabilidad y presenta un peso molecular de 47 kDA y un pH óptimo de 6.8. Las enolasas son enzimas clave altamente expresadas de glicolisis y gluconeogénesis, y catalizan la interconversión de 2-fosfo-d-glicerato y fofenolpiruvato. Ya que estas enzimas se conservan en gran medida, las investigaciones de reactividad IgE de varias enolasas fúngicas por experimentos de inhibición cruzada revelaron que la enolasa es un alérgeno fúngico de alta reactividad cruzada, como se describe en detalle a continuación.
2.5 Alt a 8
La deshidrogenasa de manosa de A. alternata dependiente de NADP, de 28.6 kDa, se reconoce por 41% de los pacientes alérgicos a A. alternata, y su reactividad cruzada con MtDH de C. Herbarum se confirmó mediante experimentos de ELISA por inhibición. Estas enzimas median la conversión reversible de manitol a fructosa en el ciclo de metabolismo del manitol, la cual sirve como almacén o carbohidratos traslocados que parecen ser necesarios para la fitopatogénesis fúngica.
2.6 Alt a 13
Alt a 13 es una proteína de 26 kDa que pertenece a la familia de proteínas de glutatión-S-transferasa. La función bioquímica de estas enzimas es la detoxificación de compuestos endógenos y xenobióticos o sus metabolitos al catalizar su biotransformación en conjugados de glutatión que presentan menos toxicidad y se excretan con más facilidad fuera de la célula que sus compuestos originales.
Shankar y colaboradores produjeron la proteína recombinante y se refirieron a Alt a 13 como un alérgeno mayor de A. alternata al demostrar que 14 de 17 pacientes con reacción a extracto de A. alternata reconocieron rGST y nGST. En un reporte reciente, los mismos autores identificaron de manera bionformática epítopos y residuos de la molécula Alt a 13 involucrada en la reactividad IgE.
2.7 Alt a 14
Las superóxido dismutasas dependientes de manganeso (MnSODs) son enzimas filogenéticamente conservadas involucradas en la defensa contra el estrés oxidativo al prevenir el daño oxidativo. El grupo de investigación de los autores identificó la MnSOD natural de A. alternata, Alt a 14, como una proteína de 24 kDa reactiva a IgE. De manera más reciente, se produjo la molécula recombinante, y se demostró que 11.5% del suero de 61 pacientes sensibilizados a A. alternata reaccionaron a rAlt a 14 por inmunoblot por IgE. En el mismo trabajo, se encontró que rAlt a 14 fue capaz de unirse a IgE de pacientes con diagnóstico clínico de aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPM), lo que sugiere que la sensibilización a este alérgeno de A. alternata se puede relacionar a la patogénesis de ABPM.
2.8 Alt a 15
Las serinas proteasas (SP), en particular SP subtilisina, se reconocen como una de las familias más importantes de las proteínas alergénicas, y se designan de manera extensa como panalérgenos. De forma reciente, una serina protesa similar a subtilisina se clonó y caracterizó como un alérgeno oficial de A. alternata, llamado Alt a 15. Un análisis por inmunoblot reveló que los anticuerpos IgE de una población sensibilizada a A. alternata se unieron a rAlt a 15 con una prevalencia de 10.2%. Además, mostró que la sensibilización mediada por IgE a este alérgeno es muy específica para pacientes polisensibilizados a hongos, en particular a Curvularia lunata.
Es bien conocido que las proteasas producidas por varias fuentes alergénicas pueden impactar la biología epitelial de manera directa, y jugar un papel importante en iniciar una respuesta alérgica en el pulmón. Las proteasas, que actúan al mismo tiempo como alérgeno, pueden aumentar las reacciones de asistencia inmunológica, al facilitar el acceso del antígeno al subepitelio y modificar de manera potencial otros alérgenos de manera que se tornen antígenos más potentes.
Además, se demostró que la actividad intrínseca específica a SP de los extractos de Alternaria alternata tienen un papel importante en la fisiopatogénesis del asma mediante la inducción de un aumento en la permeabilidad de las células epiteliales bronquiales y la promoción de una liberación rápida y robusta de mediadores innatos tempranos y una inflamación Th2 prolongada. La información mencionada de forma previa apoya la necesidad de investigar a mayor profundidad las propiedades alergénicas de las SP de A. alternata.
2.9 Proteínas alergénicas de A. alternata no-IUIS
Cinco otras proteínas de A. alternata (Alt a TCTP, Alt a NTF2, Alt a 2, Alt a 9 y Alt a 70kDa) que se reportaron capaces de unirse a IgE de pacientes sensibilizados no se encuentran en la lista oficial de alérgenos, pero están en la base de datos Allergome. La proteína de tumor controlada por traducción de A. alternata (Alt a TCTP) se caracterizó como una proteína alergénica con la habilidad demostrada de reaccionar con 4% (n = 16) de los sueros de los pacientes de A. alternata. El factor de transporte 2 de A. alternata, Alt a NTF2, se describió como una proteína de 13.7 kDa reactiva a IgE que reacciona con prevalencia baja (4 de n = 480) con el suero de pacientes sensibilizados a hongos. Sin embargo, no se estudió la prevalencia de sensibilización de la población de pacientes sensibilizados a Alternaria. Los reportes respecto a la caracterización del alérgeno Alt a 2 son controversiales. Primero, se reportó como un alérgeno mayor con una tasa de sensibilización de 61% entre pacientes sensibilizados a Alternaria. En un restudio hecho por Asturias y colaboradores, de manera sorprendente se encontró que ninguno de los 42 sueros de pacientes sensibilizados a A. alternata reaccionó a Alt a 2. Alt a 9 se identificó como una proteína de 42 kDa que se unió al 5% de los pacientes. Para las proteínas Alt a 2, Alt a 9 y Alt a 70 kDA, se desconocen la estructura química y las funciones bioquímicas. La última se reportó que induce reactividad en la piel de 87% (N = 16) de los pacientes sensibilizados a A. alternata.
2. Alérgenos de A. alternata y reactividad cruzada
El fenómeno de reactividad cruzada de alérgeno ocurre de forma típica cuando los anticuerpos IgE originalmente creados contra un alérgeno se unen o reconocen a una proteína similar de otra fuente alergénica. Dicho reconocimiento puede activar una reacción alérgica o ser por completo irrelevante para el paciente. La relevancia clínica de la reactividad cruzada depende de factores como el huésped, la exposición y el alérgeno implicado. Los alérgenos de reacción cruzada son proteínas evolutivas conservadas que tienen funciones vitales por lo que se encuentran distribuidas de manera ubicua en varias fuentes biológicas.
La reactividad cruzada de A. alternata con otras especies fúngicas aerotransportadas se describió de forma extensa, y existe evidencia de que un porcentaje significativamente alto de pacientes sensibilizados a A. alternata están polisensibilizados a más de otra especie fúngica y que también puede además estar sensibilizado a otros aeroalérgenos ambientales como polen, ácaro o incluso alimentos. Es bien conocido que la existencia de reactividad cruzada, en particular entre varios hongos, puede tener implicaciones para el diagnóstico y el tratamiento de las alergias fúngicas. En términos de diagnóstico, es común observar que, si un paciente se sensibiliza de forma primaria a proteínas alergénicas altamente conservadas, el suero del paciente puede además dar resultado positivo para un componente con reactividad cruzada de diferentes especies alergénicas de hongos. Esta ocurrencia con frecuencia complica la identificación de la especia sensibilizante primaria y resulta en un tratamiento defectuoso de la enfermedad alérgica. Desde la perspectiva diagnóstica y de tratamiento, es importante que se distinga la polisensibilización que resulta de la reactividad cruzada de la cosensibilización a múltiples fuentes alergénicas. De manera inmunológica, la cosensibilización ocurre cuando la sensibilización genuina a más de una fuente alergénica no es por reactividad cruzada debido a que no es mediada por anticuerpos específicos a epítopos compartidos. Por lo tanto, por cada fuente alergénica alergológicamente relevante, es necesario esclarecer las estructuras de reactividad cruzada y los marcadores genuinos entre el ensayo completo de alérgenos.
La mayoría de las proteínas alergénicas de Al. Alternata son al menos potencialmente reactivas entre una o varias especies. A. alternata posee alérgenos que tienen sus homólogos en 3 otros géneros que, junto con Alternaria, son los que se asocian de manera más común con el desarrollo de una alergia fúngica: Cladosporium, Penicillium y Aspergillus.
Los altos puntajes de identidad de las alineaciones son evidencia fuerte del potencial de la existencia de reacciones cruzadas IgE. Se acepta una secuencia de al menos 50% como lo requerido para reactividad cruzada alergénica; sin embargo, además se puede detectar rara vez cuando se ven las homologías secuenciales más bajas. Las diferencias en la secuencia o la estructura de los aminoácidos, su localización o la cantidad de proteínas alergénicas reflejan las diferencias de las propiedades alergénicas de los homólogos y son los factores determinantes de la reactividad cruzada.
En relación al alérgeno mayor de A. alternata, la base de datos de Allergome incluye una lista de 171 proteínas relacionadas a Alt a 1 de varias especies de Alternaria y taxones relacionados; sin embargo, hasta la fecha, no se evaluó la evidencia de la reactividad IgE para la mayoría de estas moléculas. De hecho, la mayoría de los taxones relacionados a A. alternata se describen como asociados de forma principal con la patogenicidad de plantas, y la descomposición y el biodeterioro de frutas, productos alimenticios y comidas en vez de fuentes alergénicas ambientales. El análisis de la diversidad molecular de Alternaria intramuros aislados en EUA reveló que las especies de Alternaria sección Alternaria representaron 98% (153 aisladas), de las cuales 137 aisladas se asignaron a A. alternata, 15 a A. arborescens y una aislada única a A. burnsii. Gutiérrez-Rodríguez y colaboradores demostraron que las especies fúngicas de la familia Pleosporaceae, como Stemphylium y Ulocladium, tienen un alérgeno común que muestra un alto nivel de reactividad cruzada con Alt a 1 de A. alternata.  Dada la escasa, pero existente evidencia de la alergenicidad de homólogos de Alt a 1 e incluso con sus frecuencias bajas esperadas como contaminantes ambientales, evaluar la presencia de otras especies que liberan proteínas similares a Alt a 1 podría contribuir a la carga alergénica total de Alt a 1 a la que se exponen los pacientes atópicos y podría ser una tarea interesante a considerar más adelante.
Los alérgenos de A. alternata restantes son proteínas más filogenéticamente conservadas que se reconocen como alérgenos fúngicos de reacción cruzada que pueden reaccionar con proteínas homólogas de otras especies fúngicas, pero además con organismos de diferentes phylas. Múltiples reportes presentan la mediación de la reactividad cruzada entre los alérgenos menores de A. alternata y otras especies alergénicas fúngicas. Entre estos, la enolasa (Alt a 6), para la cual se demostró reactividad cruzada con Cladosporium, Saccharomyces, Candida, Aspergillus y Hevea brasiliensis, se considera como el alérgeno con reactividad cruzada a A. alternata con mayor importancia alergológica de manera fundamental en términos de diagnóstico.
De forma reciente, se hicieron esfuerzos por identificar y caracterizar dos nuevos alérgenos con reactividad cruzada: Alt a 14, un MnSOD y Alt a 15, una SP vacuolar. En los experimentos de los autores, estos dos alérgenos en apariencia desempeñan un papel en los fenómenos de reactividad cruzada entre A. alternata y otros hongos alergénicos, de manera específica A. fumigatus y C. lunata. En específico, se encontró que Alt a 14 mostró reactividad cruzada con Asp f 6, un alérgeno de A. fumigatus que junto con Asp f 4, se considera como un marcador específico para ABPA. Algunos estudios se refieren a A. alternata como uno de los agentes etiológicos potenciales de esta enfermedad mediada por hipersensibilidad de las vías aéreas inferiores. Relacionado a esto, Jubin y colaboradores observaron una asociación significativa de ABPA con una sensibilización previa concomitante a Alternaria y propusieron que podría ser el resultado de reactividad cruzada alergénica entre productos de especies de Alternaria y Aspergillus. Por lo tanto, ya que rAlt a 14 también se unió a IgE de suero de pacientes con ABPA, se sugirió que esta MnSOD podría tener implicaciones importantes en la sensibilización a A. alternata como factor de riesgo para el desarrollo de ABPA. Además, se describió que los alérgenos de la familia de proteínas de MnSOD podrían presentar reacción cruzada a MnSOD homóloga humana, lo cual podría contribuir a la perpetuación de la respuesta inflamatoria en el asma.
Se reportan asociaciones entre la sensibilización a hongos aerotransportados (A. alternata, C. herbarum y A. fumigatus) y alergia alimentaria, de manera específica a hongos y espinaca. En un reporte reciente de caso, se asoció una sensibilización previa a A. alternata con una reacción alérgica grave a alimentos con proteínas homologas de reactividad cruzada de hongos. Se identificaron MtDH y MnSOD del hongo Agaricus bisporus con homología significativa a Alt a 8 y ALt a 14 como proteínas de unión a IgE específicas de paciente.
Aunque un gran número de especies fúngicas comparten moléculas homólogas de unión a IgE, no todas ellas poseen la misma importancia clínica. De hecho, como ejemplo, los panalérgenos fúngicos bien reconocidos pertenecientes a la familia de proteínas de serinas proteasas son alérgenos mayores en varios hongos, de manera específica especies de Aspergillus, Cladosporium, Curvularia, Penicillum, Rhodotorula y Trichophyton; sin embargo, el homólogo de A. alternata (Alt a 15) presenta una prevalencia relativamente baja de reconocimiento entre pacientes sensibles a A. alternata. Las diferencias cuantitativas más que las cualitativas, la cantidad liberada de alérgeno, por ejemplo, podrían explicar por qué algunas de las proteínas son alérgenos menores o mayores de acuerdo a la especie productora de hongo.
Dado a que un número significativamente alto de pacientes sensibilizados a A. alternata están polisensibilizados a otros aeroalérgenos que están presentes de manera simultánea en frecuencias altas como pasto, olivo, epitelio de gato, Dermatophagoides y ciprés, se debe considerar la existencia de fenómenos adyuvantes o de reacción cruzada.
4. Alérgenos de Alternaria y su información filogenética
De manera tradicional, las especies fúngicas se categorizan de forma sistémica según sus características morfológicas. Sin embargo, en años recientes, surgieron abordajes filogenéticos prometedores basados principalmente en una secuencia de comparación de genes de RNA ribosomal y permitieron una clasificación más avanzada para los hongos. De manera simultánea, se incrementó la propuesta que el conocimiento de biología fúngica y cómo evoluciona podrían explicar la naturaleza antigénica de especies de hongos alergológicamente importantes.
El proceso evolutivo parece ser el responsable por la observación que un número limitado de especies fúngicas producen un alérgeno específico que se reconoce de manera amplia por el sistema inmunológico humano. De hecho, el sistema inmunológico de cada individuo atópico reconocerá las proteínas extrañas existentes en el ambiente, y el grado de la naturaleza extraña del alérgeno reconocido es muy dependiente de su distancia evolutiva de las proteínas humanas. Por lo tanto, de manera reciente, Soeria-Atmadja y colaboradores demostraron que los patrones de sensibilización de IgE de pacientes sensibilizados a hongos reflejan las relaciones filogenéticas fúngicas. Estas observaciones reflejan la premisa de que los hongos con una relación filogenética más estrecha comparten más antígenos.
La existencia de alérgenos compartidos entre las especies fúngicas que causan reactividad cruzada IgE sugiere que algunos genes que codifican para alérgenos reconocidos por anticuerpos IgE se puedan utilizar como marcadores filogenéticos poderosos que son útiles para categorizar los hongos de forma sistemática e identificar proteínas que causan reactividad cruzada IgE en el reino fúngico. En este aspecto, ya que A. alternata se considera como el mayor productor de alérgenos fúngicos, se propone que la información del proceso evolutivo para la codificación de genes para el alérgeno puede ser valiosa para comprender la importancia de los alérgenos en la biología fúngica y la estimulación de la respuesta alérgica. Por lo general, los estudios moleculares basados en proteínas de alérgenos fúngicos son limitados, pero prometedores. En uno de sus estudios, Hong y colaboradores encontraron homólogos génicos del alérgeno mayor de A. alternata, Alt a 1, de manera exclusiva en Alternaria y especies relacionadas taxonómicamente. En este mismo estudio, los autores utilizaron Alt a 1 como un marcador molecular para producir árboles filogenéticos de Alternaria y taxones relacionados con resolución alta y soportes bootstraps (conjunto de herramientas y procedimientos para que un entorno se construya a sí mismo). Efectivamente, el proceso evolutivo parece llevar al desarrollo de una proteína alergénica específica para una especie, Alt a 1, la cual se restringe a varias especies fúngicas alergénicas relacionados de manera filogenética a A. alternata que pertenecen a la familia Pleosporaceae. Este proceso probablemente explica la razón por la cual Alt a 1 es el sensibilizador primario principal en una población sensibilizada a hongos y se considera de forma amplia como un marcador de sensibilización para miembros de Pleosporaceae. Dado su alto contenido filogenético, la proteína y el gen Alt a 1 pueden ser útiles para identificar de manera inequívoca y detectar un grupo restringido de especies fúngicas; este problema se atenderá en extenso más adelante. En contraste, como se describió de forma previa, la mayoría de las proteínas alergénicas de A. alternata son alérgenos menores que poseen homólogos en varias especies fúngicas.
La distribución taxonómica de los alérgenos homólogos de Alternaria se puede correlacionar altamente con la sensibilización e información de reactividad cruzada. Las especies filogenéticamente relacionadas a A. alternata es probable que produzcan un arreglo de alérgenos similares y por lo tanto producir patrones de sensibilización similares, donde especies filogenéticamente distantes solo compartirán moléculas de reactividad cruzada ubicuas, lo que explica por qué la información de sensibilización inducida de IgE muestra menos correlación. El árbol jerárquico basado en IgE propuesto por Soeria-Atmadja y colaboradores colocó A. alternata en el racimo de especies Pleosporales con la menor similitud a otras especies de la misma orden. Dado a que este estudio incluye sólo algunos miembros Pleosporales (Curvularia lunata, Stemphylium herbarum, Epicoccum purpurascens, Phoma betae y Setomelanomma rostrata) en los que no se describe una proteína similar a Alt a 1, la similitud baja del patrón de sensibilización refleja, como era esperado, que los pacientes se sensibilizan a A. alternata principalmente mediante Alt a 1. Se deben realizar estudios similares a futuro que incluyan números mayores de especies fúngicas, de manera específica aquellas filogenéticamente cercanas a A. alternata. Esto permitirá obtener el patrón completo de asociación entre la información molecular fúngica sistémica y sensibilización de IgE al concretar el valor de Alt a 1 y otros componentes fúngicos de reacción cruzada en la delineación de una organización jerárquica entre los hongos relacionados a alergia.
Para establecer análisis filogenéticos completos conducidos en codificación de genes para alérgenos reconocidos por anticuerpos IgE y correlacionar de manera completa la información con la respuesta del sistema inmune mostrada en pacientes sensibilizados a hongos, es crítica la investigación de los homólogos de proteínas alergénicas existentes entre especies fúngicas.
5. Exposición a alérgenos de A. alternata y su evaluación
La medición aérea de la exposición a hongos mostró que el aumento en los niveles atmosféricos de esporas fúngicas se relaciona con manifestaciones graves de respuestas alérgicas respiratorias, incidencia de ingresos hospitalarios y muertes relacionadas a asma.
El umbral necesario de conteo en el aire de Alternaria para inducir síntomas alérgicos se estima en 100 esporas/m3. Comparado con la concentración asociada con el inicio de síntomas alergénicos para esporas de Cladosporium (3000 esporas/m3), que junto con Alternaria son las esporas de hongos distribuidas de forma más amplia en los estudios aerobiológicos, es clara la alergenicidad potente de Alternaria. Esto concuerda con un estudio previo, donde la comparación entre sensibilización a hongos con sus conteos correspondientes de esporas en el mismo ambiente mostró que Alternaria presentó un puntaje significativamente más alto para la sensibilización.
El conocimiento de las características aerodinámicas y la distribución de alérgenos y cómo y cuándo aumenta la exposición es esencial para tratar de establecer la relación entre la exposición a alérgenos y la respuesta inmune específica. La distribución de Alternaria se reporta relacionada al área geográfica, la estación, la condición atmosférica y la hora del día. Dado a que las especies de Alternaria son fitopatógenos prevalentes, la concentración de esporas aeroalergénicas se puede asociar a la liberación de esporas de plantas infectadas; por lo tanto, las áreas donde son más prevalentes las actividades agrícolas podrían conducir a la diseminación ambiental de esporas alergénicas de A. alternata.
La exposición a hongos difiere de los alérgenos ambientales prevalentes, como pólenes, tanto en cantidad como en duración de exposición a la fuente alergénica. De hecho, los conteos de esporas aéreas son con frecuencia 1000 veces mayores a los conteos polínicos, y por lo general ocurre una exposición intensa a esporas de Alternaria por varios meses. De manera típica, la exposición a pólenes, como ambrosía, por ejemplo, ocurre por semanas. Sin embargo, debido a que el patrón de exposición al polen también se describe como variable de acuerdo a la especie, la ubicación geográfica y las condiciones climáticas, la temporada de polen puede durar meses.
Se documentó que los pacientes asmáticos sensibilizados a Alternaria tienden a sufrir desenlaces más graves durante finales de verano y principios de otoño, cuando se registran los conteos más altos de esporas de Alternaria. Pulimood y colaboradores reportaron que la epidemia de asma relacionada a tormentas eléctricas se asoció fuertemente con la sensibilización a especies de Alternaria y la ruptura de las esporas resulta en fragmentos alergénicos que se inhalan con facilidad. Una concentración alta de esporas fúngicas, su transportación a lo largo de grandes distancias y otros factores ambientales que podrían contribuir a la hiperreactividad bronquial se asocian con tormentas eléctricas, como el ozono y una disminución repentina de la temperatura, y podrían explicar la asociación. Dado a que las especies de Alternaria crecen en los cereales, se propuso que las prácticas de agricultura contribuyen al aumento en los niveles de esporas fúngicas. El cambio climático global y la concentración de CO2 también parecen estimular la esporulación de A. alternata y la producción total de antígenos, también consistentes con el aumento en la prevalencia de alergia al polen y la gravedad del asma.
La presencia intramuros de alérgenos de A. alternata también se detectó, de manera específica al colonizar textiles como alfombras y ropa de cama. En una encuesta intramuros de EUA, la prevalencia de asma sintomática se relacionó fuertemente con el conteo de A. alternata en las muestras de polvo doméstico de los pacientes.
Dado a los efectos negativos significativos de A. alternata en la salud humana y de las plantas, la definición correcta de A. alternata y sus alérgenos es de gran importancia no sólo en el ámbito clínico, sino en el ambiental, epidemiológico y de patología de las plantas. Varias estrategias evolucionaron para muestrear, identificar e interpretar la exposición a los hongos. Los métodos tradicionales de identificación y evaluación de exposición a hongos se basan en características morfológicas y el conteo de esporas. La delineación de especies de Alternaria se complica por métodos que tienen varias limitantes asociadas; estos métodos toman tiempo, son laboriosos y no siempre son confiables ya que requieren las habilidades de personal capacitado.
De manera reciente, la información epidemiológica obtenida por métodos tradicionales se usó de forma activa para proteger y mejorar la calidad de vida en los pacientes sensibilizados/alérgicos, aunque se requiere mucho trabajo en este campo. Se unieron varios métodos basados en proteínas y DNA y se consideran como herramientas útiles para monitorear los niveles de exposición a un ambiente intramuros o extramuros en particular. Se pueden realizar en un gran número de muestras, a menudo de forma rápida y sin la necesidad de habilidades técnicas micológicas.
Los métodos basados en proteínas incluyen inmunoensayos como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) que usa anticuerpos poli o monoclonales para cuantificar antígenos de A. alternata. En la actualidad, existen algunos kits de ELISA disponibles de manera comercial para la detección específica y la cuantificación del alérgeno mayor de A. alternata, Alt a 1. Las técnicas de ELISA se basan en la interacción entre anticuerpos y alérgenos específicos, y la posibilidad de reactividad cruzada con otras proteínas no blanco, de manera específica proteínas homólogas de otras fuentes, y pueden llevar a falsos positivos. Las ventajas principales de los inmunoensayos como ELISA son que dan resultados cuantitativos y permiten la evaluación directa del antígeno con un costo bajo, tiempo moderado del procedimiento y sin requerimientos especiales de experiencia de expertos.
De manera reciente, Meng y colaboradores no encontraron una diferencia significativa en la tasa de detección de Alternaria entre casas de pacientes asmáticos y no asmáticos mediante el conteo de esporas o la detección cultivable de aeroalérgenos. Sin embargo, en un estudio transversal previo, un ensayo de anticuerpos policlonales contra Alternaria se utilizó de forma exitosa para detectar alérgenos de Alternaria en hogares en EUA; se observó que la exposición a alérgenos de A alternata en hogares en EUA se asocia con síntomas activos de asma. El mismo ensayo permitió concretar que en los niveles de antígenos de Alternaria influyen no sólo las características regionales y domiciliarias, sino también los hábitos de los residentes. El uso de un ELISA basado en anticuerpos monoclonales confirmó que el riesgo de síntomas respiratorios en pacientes sensibilizados a A. alternata se correlacionó de forma significativa con niveles atmosféricos de Alt a 1. El ELISA por captura se describió como un ensayo sensible, específico y reproducible para la detección de Alt a 1 en muestras de polvo recolectadas en granjas de aves.
De manera alternativa, el desarrollo de métodos basados en DNA permitió cuantificar de manera más confiable las especies fúngicas. Surgieron varios métodos de detección y cuantificación basados en PCR con costos de inicio y tiempos de ejecución aceptables. Dado su contenido muy variable, el alto número de copias por célula y las secuencias depositadas en bases de datos internacionales, las regiones de espaciadores de transcripción interna (ITS) del gen rRNA se utilizan como blanco para evaluar la diversidad fúngica en las muestras ambientales. Las principales ventajas de dichas técnicas moleculares son su especificidad y mínima susceptibilidad a fenómenos de reactividad cruzada ya que la secuencia blanco puede adaptarse de secuencias blanco codificadoras para el alérgeno a marcadores DNA específicos para una especie. A pesar de las ventajas de los métodos basados en DNA, la PCR aún es muy controversial ya que cuando se detecta un gen que codifica para un alérgeno, no necesariamente implica su expresión. De manera consecuente, los resultados obtenidos por detección por DNA no toman en cuenta el potencial alergénico actual. Sin embargo, lo mismo ocurre con algunas, si no es que la mayoría de las pruebas ELISA que no necesariamente detectan las proteínas alergénicas, sino marcadores proteicos específicos para una especie. De hecho, la detección de un marcador molecular da información indirecta sobre el potencial alergénico, pero da evidencia de la presencia del ingrediente alergénico.
Un estudio molecular reciente demostró que Alt a 1 se puede utilizar como marcador para detectar de manera exitosa Alternaria alergénica y patogénica y otros taxones relacionados por PCR. El sistema de PCR que usa un set de cebador que se diseñó de acuerdo a la conservación de secuencias de nucleótidos que codifican Alt a 1 pudo detectar todas las especies productoras de Alt a 1 incluidas en el estudio (A. alternata, A. tenuissima, A. infectoria, U. Botrytis y S. Botryosum). En contraste, el uso de un segundo juego de cebador, utilizado de forma previa por otros autores para la producción de Alt a 1 recombinante, permitió la detección de las especies con relación taxonómica estrecha A. alternata y A. tenuissima.
6. Diagnóstico por componentes basado en alérgenos: una nueva era de diagnóstico de la alergia a Alternaria
Por lo general, se acepta que el diagnóstico de una alergia debe basarse en la historia clínica de los síntomas y mediante ensayos confirmatorios que pueden incluir la determinación de anticuerpos específicos IgE mediante pruebas cutáneas, análisis in vitro o pruebas de provocación.
De acuerdo a un grupo paneuropeo grande de estudio de pruebas cutáneas GA(2)LEN, se debe incluir un extracto de Alternaria en la batería mínima estándar de aeroalérgenos utilizada para evaluar de forma apropiada la sensibilización en Europa.
La combinación de pruebas cutáneas y la determinación de niveles de IgE específica para alérgenos en suero se recomienda en la actualidad para una evaluación confiable de sensibilización a Alternaria. En investigaciones diagnósticas, los extractos crudos se usan de forma amplia. Sin embargo, existen varias limitantes asociadas con el uso de extractos complejos completos que incluyen la presencia de moléculas irrelevantes y alérgenos con potencial alto de reactividad cruzada, la representación limitada de algunos alérgenos y la variabilidad bien documentada entre las preparaciones de extractos crudos. Este podría ser el origen de la concordancia baja entre las SPT y los resultados de IgE sérica para Alternaria.
Algunos estudios que investigaron el contenido bioquímico e inmunológico de las soluciones de Alternaria para pruebas cutáneas encontraron una variabilidad alta con respecto a su contenido de proteína, antígeno y alérgeno. Muchos factores atribuidos a los diferentes pasos de la producción de extractos fúngicos pueden ser responsables para una preparación inconsistente para pruebas cutáneas, lo que puede resultar en un diagnóstico erróneo. El uso de una cepa específica de hongo y las condiciones de cultivo preferidas por el fabricante se consideran como la primera fuente de variación. Entonces, diferentes métodos de extracción, con o sin aditivos y sistemas de cuantificación final de alérgeno son también fuentes potenciales de variabilidad. De manera reciente, Twaroch y colaboradores observaron que las cepas de Alternaria, los componentes nutricionales del medio y el periodo de crecimiento tienen un impacto enorme sobre la presencia de proteínas de unión a IgE en el extracto final. Con respecto al alérgeno de Alternaria más relevante de forma clínica, se demostró que la expresión de Alt a 1 es muy dependiente del tiempo de crecimiento fúngico, el medio de cultivo y la cepa. En casos de pacientes polisensibilizados, la aplicación de métodos diagnósticos basados en extractos obtenidos de fuentes alergénicas relacionadas y no relacionadas, donde las existencias de alérgenos de reactividad cruzada son bien conocidas, resulta difícil identificar el sensibilizador primario; por ende, no permite la discriminación entre reactividad cruzada y cosensibilización.
Para superar las limitantes del diagnóstico basado en extractos crudos, está disponible de forma amplia en Europa el diagnóstico molecular o resuelto por componentes (CRD) con moléculas alergénicas recombinantes individuales o nativas probadas en un inmunoensayo de fluorescencia en enzima (ImmnoCAP) o una plataforma basada en microarreglos. La disponibilidad de alérgenos recombinantes de calidad alta para los avances recientes en tecnología de DNA recombinante para investigación de alérgenos permitió la definición de perfiles de sensibilización individual y una comprensión de la naturaleza de la sensibilización, así como marcadores notables de gravedad, persistencia o reactividad cruzada. Por lo tanto, se pueden tomar decisiones informadas con respecto a las estrategias para inmunoterapia para alérgenos específicos.
Hasta la fecha, sólo dos alérgenos (rALt a 1, rAlt a 6) están disponibles de manera comercial para el diagnóstico molecular de alergia a Alternaria. Se aceptó de forma reciente que el uso del alérgeno específico para la especie, Alt a 1, en el diagnóstico molecular, indica una sensibilización genuina a A. alternata, aún si los alérgenos homólogos cercanos puedan ocurrir en el reino fúngico. Sin embargo, en ausencia de sensibilización a Alt a 1, la aplicación de alérgeno individual de A. alternata con reactividad cruzada conocida puede mejorar la sensibilidad diagnóstica, y permitir la identificación de sensibilización cruzada y la definición inequívoca de sensibilizadores primarios en casos de polisensibilización.
En un estudio preliminar, el uso de dos moléculas recombinantes, Alt a 1 y Alt a 6, en pruebas cutáneas pareció diagnosticar de manera correcta 7 pacientes sensibilizados a Alternaria. Asturias y colaboradores observaron que remplazar extractos de A. alternata con formas naturales o recombinantes de Alt a 1 pareció suficiente para un diagnóstico confiable de sensibilización a Alternaria. De manera reciente, Postigo y colaboradores revelaron que 2 de 30 pacientes alérgicos a A. alternata no presentaron reacción con Alt a 1 o Alt a 6 pero mostraron reacción potencialmente por reactividad cruzada con MnSOD, ahora llamada de manera oficial Alt a 14; de acuerdo a los autores, Alt a 14 debe incluirse en el diagnóstico molecular del arreglo de alérgenos.
Se espera que la identificación y la caracterización del arreglo completo de alérgenos de Alternaria y las nuevas técnicas basadas en proteínas recombinantes van a permitir la preparación de soluciones para pruebas de mejor calidad, mejorar el diagnóstico de alergia a Alternaria y guiar a una inmunoterapia específica más efectiva con una o pocas moléculas alergénicas. De hecho, desde el punto de vista clínico, lograr materiales biológicos de buena calidad para el diagnóstico y la inmunoterapia de pacientes alérgicos es uno de los aspectos críticos a considerar en el campo de la alergia mediada por IgE. Como se mencionó de forma previa, la ausencia de un extracto estandarizado puede sin duda tener relevancia clínica y remplazar extractos crudos con alérgenos purificados puede contribuir a resolver este problema. Sin embargo, aún queda un camino largo hasta que la inmunoterapia para la alergia a hongos sea segura y exitosa. Los pasos más importantes para alcanzar un tratamiento efectivo para la alergia fúngica son, en efecto, el diagnóstico certero y la evaluación de la exposición a A. alternata y sus componentes individuales. Ya que A. alternata es principalmente un alérgeno extramuros, es difícil de lograr la evitación como medida preventiva; sin embargo, los avances en la investigación aerobiológica orientada a definir la extensión y la duración de la exposición podrán dar información sobre la implementación de medidas de protección apropiadas a nivel individual y poblacional. Por lo tanto, de manera ideal los centros de conteo de aeroalérgenos deberían poder predecir las epidemias a futuro y alertar a los pacientes con sensibilización a hongos para evitar zonas o actividades en zonas con alta carga de alérgenos/esporas, el uso de equipo protector (mascarillas) y/o tratamiento profiláctico. Además, algunos cuidados, en especial en casa, pueden reducir y/o evitar la exposición intramuros a especies fúngicas alergénicas. La limpieza regular para evitar el acúmulo de detritos y polvo, reducir la humedad en edificios para evitar problemas relacionados a la humedad y evitar el tabaquismo intramuros son algunas de las medidas preventivas reportadas que pueden abatir el crecimiento fúngico intramuros.
7. Conclusión
Comparado con otras fuentes alergénicas comunes, los hongos se reportan como desatendidos y subestimados. Al continuar en aumento las alergias a A. alternata, tiene sentido permitir la investigación sobre el rol de esta especie fúngica y sus componentes alergénicos, en particular en el asma. Establecer correlaciones de exposición a A. alternata y los síntomas alérgicos es aún problemático. Es críticamente importante adoptar un abordaje multidisciplinario que utilice tanto herramientas epidemiológicas y moleculares para evaluar con certeza las tendencias de exposición a A. alternata y sus alérgenos individuales para determinar los efectos potenciales en la salud.
Como se presentó en esta revisión, los alérgenos de A. alternata se pueden considerar marcadores potentes de filogenia, sensibilización y exposición. La caracterización completa de los alérgenos fúngicos y el análisis de un patrón distintivo de la distribución de especies alergénicas podrá ayudar para comprender y predecir la reactividad cruzada y para mejorar los métodos diagnósticos de alergia. Además, comprender el contenido filogenético de los alérgenos únicos y compartidos dará nuevas perspectivas en la biología fúngica, la alergenicidad y las respuestas inmunológicas inducidas por hongos.

Review article

Alternaria alternata allergens: Markers of exposure, phylogeny and risk of fungi-induced respiratory allergy


Centro Regional de Alergia e Inmunología Clínica CRAIC, Hospital Universitario “Dr. José Eleuterio González” UANL, Monterrey, México

Dra. med. Sandra Nora González Díaz         Jefe y Profesor
Dr. Alfredo Arias Cruz                                 Profesor
Dr. Mauricio Gerardo Ochoa Montemayor   Residente 1er Año
Dra. Alejandra Macías Weinmann                Profesor


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